腦心通06號對血管平滑肌細(xì)胞增殖影響課題研究科會課件

腦心通對氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響研究者:婁莉王東琦2013N-KH-06號腦心通對氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響研究者:1實(shí)驗(yàn)背景正常狀態(tài)下,平滑肌細(xì)胞的功能主要是通過不斷收縮與松弛起到調(diào)節(jié)血流的作用.在一些刺激作用下(如脂蛋白的作用,由損傷引起的炎癥反應(yīng))平滑肌細(xì)胞可出現(xiàn)表型的改變,細(xì)胞呈收縮型向合成型的轉(zhuǎn)換.實(shí)驗(yàn)背景正常狀態(tài)下,平滑肌細(xì)胞的功能主要是通過不斷收縮與松弛2當(dāng)處于合成型,平滑肌細(xì)胞通過表面的受體接受外來生長因子的調(diào)節(jié)而大量增殖,由中膜向內(nèi)膜遷移,在內(nèi)膜增生,合成包括膠原蛋白,彈性纖維和多糖等大量細(xì)胞外基質(zhì).使得平滑肌細(xì)胞在動脈粥樣硬化的纖維性增生中起重要作用.當(dāng)處于合成型,平滑肌細(xì)胞通過表面的受體接受外來生長因子的調(diào)節(jié)3實(shí)驗(yàn)背景ox-LDL通過誘發(fā)一系列與細(xì)胞增殖有關(guān)的反應(yīng),包括增加原癌基因(如c-fos,c-sis基因)的表達(dá),刺激內(nèi)皮細(xì)胞,單核巨噬細(xì)胞,血小板和增生的平滑肌細(xì)胞自身釋放大量的生長因子和細(xì)胞因子,促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖.實(shí)驗(yàn)背景ox-LDL通過誘發(fā)一系列與細(xì)胞增殖有關(guān)的反應(yīng),包括4實(shí)驗(yàn)背景一些離體實(shí)驗(yàn)提示他汀類藥物可以直接或間接參與平滑肌細(xì)胞凋亡,并且在24小時觀察到細(xì)胞周期停滯于G1期.氟伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀和西伐他汀(cerivastatin)均呈劑量依賴性抑制鼠和人VSMC增殖抑制人股動脈VSMC增殖的他汀類藥物濃度比較如下:西伐他汀<洛伐他汀≈辛伐他汀≈阿托伐他汀≈氟伐他汀<普伐他汀流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),10-4mol/L的氟伐他汀抑制人和豬VSMCG/S期轉(zhuǎn)換,使其僅為對照組的50%。實(shí)驗(yàn)背景一些離體實(shí)驗(yàn)提示他汀類藥物可以直接或間接參與平滑肌細(xì)5張敬賢等在臨床對照研究中觀察到腦心通可改善心絞痛臨床癥狀,有調(diào)脂抗氧化的雙重作用,；張加力觀察到腦心通對患者血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)有明顯干預(yù)作用。劉思泰,李德才,云紅梅等認(rèn)為腦心通膠囊對緩解冠心病不穩(wěn)定心絞痛有明顯的療效,其機(jī)理可能是通過改善血管內(nèi)皮功能,降低ET水平和促進(jìn)NO釋放而發(fā)揮作用;也可能與其改善血管壁慢性炎癥有關(guān)。

張敬賢等.步長腦心通治療冠心病合并血脂紊亂的療效觀察,中國中藥雜志,2002,9,27,9:705~706

楊君玲

步長腦心通治療冠心病心絞痛60例報告,山東醫(yī)藥,2004,44,23:51~52

張加力,杜立樹等.腦心通膠囊對87例冠心病患者血清CPR的影響,JTCM.2006,Vol.47,No.6:472劉思泰,李德才,云紅梅等.腦心通對不穩(wěn)定型心絞痛患者血管內(nèi)皮功能及超敏C反應(yīng)蛋白的影響,中藥藥理與臨床,2007,23(3):77~79張敬賢等在臨床對照研究中觀察到腦心通可改善心絞痛臨床癥狀,有6實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠冒⑼蟹ニ∽鰧φ?觀察在體外實(shí)驗(yàn)中腦心通是否對平滑肌細(xì)胞增殖有抑制作用,并探討其可能機(jī)制．實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠冒⑼蟹ニ∽鰧φ?觀察在體外實(shí)驗(yàn)中腦心通是否對平滑7實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)用SMCs，分為6組：1空白對照組

2ox-LDL組3ox-LDL+阿托伐他汀組(終濃度10-4mol/l)4ox-LDL+腦心通組(終濃度1g/L)5ox-LDL+腦心通組(終濃度0.5g/L)6ox-LDL+腦心通組(終濃度0.1g/L)實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)用SMCs，分為6組：8實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)48小時終止培養(yǎng)MTT比色法比較各組OD值,間接反應(yīng)活的平滑肌細(xì)胞數(shù)量實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)48小時終止培養(yǎng)9流式細(xì)胞儀測定DNA含量分析確定各組細(xì)胞中細(xì)胞周期G1期S期G2期所占百分?jǐn)?shù)觀察加入不同藥物對細(xì)胞在細(xì)胞周期運(yùn)行過程中的影響腦心通06號對血管平滑肌細(xì)胞增殖影響課題研究科會課件10流式細(xì)胞儀Annexin-v-FITC和PI雙標(biāo)記細(xì)胞觀察藥物對細(xì)胞凋亡的作用流式細(xì)胞儀Annexin-v-FITC和PI雙標(biāo)記細(xì)胞觀察藥11培養(yǎng)SMCs對照組OxLDL組阿托伐他汀組腦心通組腦心通組腦心通組MTT比色法碘化丙啶染色流式細(xì)胞術(shù)（PI/FCM）細(xì)胞周期測定流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡測定MDA水平測定培養(yǎng)SMCs對照組OxLDL組阿托伐他汀組腦心通組腦心通組腦12實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.MTT檢測細(xì)胞生長抑制率2.流式細(xì)胞儀測各細(xì)胞周期百分?jǐn)?shù)3.流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.MTT檢測細(xì)胞生長抑制率131.MTT檢測細(xì)胞生長抑制率

噻唑蘭（MTT）可透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶于水的藍(lán)紫色的針狀結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，結(jié)晶物能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。用阿托伐他汀和不同濃度腦心通作用24小時檢測吸收值，并計算細(xì)胞生長抑制率。1.MTT檢測細(xì)胞生長抑制率

噻唑蘭（MTT）可透過細(xì)胞14表1不同藥物對VSMC增殖的影響（n=6,x±s)）組別劑量OD值對照——0.509±0.036*Ox-LDL10mg/mL0.733±0.033Ox-LDL+阿托伐他汀0.1mmol/L0.519±0.057*Ox-LDL+腦心通

1g/L0.672±0.035**Ox-LDL+腦心通0.5g/L0.702±0.058Ox-LDL+腦心通0.1g/L0.700±0.041與ox-LDL組相比*P<0.01，**P<0.05表1不同藥物對VSMC增殖的影響（n=6,x±s)）組別劑量15與空白對照組相比,ox-LDL組OD值明顯增加,VSMC表現(xiàn)為增殖狀態(tài)(P<0.01)。阿托伐他汀和腦心通（1g/L）均可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC增殖(P<0.01;P<0.01)。腦心通的作用呈現(xiàn)劑量依賴的趨勢(見表1)。

與空白對照組相比,ox-LDL組OD值明顯增加,VSM162.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞含量流式細(xì)胞儀檢測顯示ox-LDL有促VSMCs增殖的作用，表現(xiàn)為G0/G1期的細(xì)胞比例顯著降低，S期的細(xì)胞比例顯著增高(與對照組相比P<0.01)，阿托伐他汀和大劑量的腦心通均可增加G0/G1期細(xì)胞比例，降低S期的細(xì)胞比例，與ox-LDL組相比，差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)2.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞含量流式細(xì)胞儀檢測顯示ox17表2

不同藥物對VSMC細(xì)胞周期運(yùn)行的影響(n=3，x±s)組別劑量G0G1（%）G2+S+M（%）對照——71.26±1.12*28.41±0.59*Ox-LDL10mg/mL51.67±9.6448.33±9.64Ox-LDL+阿托伐他汀0.1mmol/L69.78±3.22*30.21±3.22*Ox-LDL+腦心通1g/L64.70±5.54**35.30±5.54**Ox-LDL+腦心通0.5g/L61.54±5.8238.46±5.82Ox-LDL+腦心通0.1g/L59.60±6.1140.40±6.11與ox-LDL組相比*P<0.01,**P<0.05表2不同藥物對VSMC細(xì)胞周期運(yùn)行的影響(n=3，x±s)18腦心通06號對血管平滑肌細(xì)胞增殖影響課題研究科會課件193流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

在細(xì)胞凋亡早期，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS)遷移至細(xì)胞膜外測。磷脂結(jié)合蛋白V（AnnexinV）是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它與PS具有高度的結(jié)合力。因此，AnnexinV可以作為探針檢測暴露在細(xì)胞外測的磷脂酰絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的AnnexinV，將AnnexinV標(biāo)記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時結(jié)合使用PI拒染法（因壞死細(xì)胞PS亦暴露于細(xì)胞膜外測，且對PI高染）進(jìn)行凋亡細(xì)胞雙染法后用流式細(xì)胞儀可檢測凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞AnnexinV高染、PI低染；壞死細(xì)胞AnnexinV/PI均高染。3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

在細(xì)胞凋亡早期，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷20組別劑量AV+PI+空白對照——0.347±0.1521.610±0.570Ox-LDL10mg/L0.108±0.0381.793±1.22Ox-LDL+阿托伐他汀0.1mmol/L1.787±0.361*2.737±0.316Ox-LDL+腦心通1g/L0.633±0.0762.560±0.497Ox-LDL+腦心通0.5g/L0.523±0.0872.397±0.602Ox-LDL+腦心通0.1g/L0.540±0.1152.740±0.072與空白對照組相比*P<0·01組別劑量AV+PI+空白對照——0.347±0.1521.621流式細(xì)胞儀檢測顯示，ox–LDL組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.117），提示10mg/Lox–LDL無明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。阿托伐他汀與空白對照組比較凋亡率增加(P<0.01)，而各組腦心通均無此現(xiàn)象(P=0.067,P=0.238,P=0.199)。各組細(xì)胞PI高染率之間無顯著差異，提示各組藥物對細(xì)胞無毒性作用。流式細(xì)胞儀檢測顯示，ox–LDL組與空白對照組差異無統(tǒng)計22討論現(xiàn)代動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均已證實(shí)，腦心通具有降脂、緩解心絞痛及改善腦梗死的作用目前不能判定其中的有效成分或哪些成分起主導(dǎo)作用。但是其中丹參、黃芪、川芎、水蛭等單方在研究中均有通過抑制VSMC通過細(xì)胞周期限制點(diǎn)，使細(xì)胞處于靜止期來抑制細(xì)胞增殖的作用在本實(shí)驗(yàn)中腦心通的作用雖然弱于阿托伐他汀，但中藥復(fù)方的優(yōu)勢在于方中各藥配伍后可起到協(xié)同或拮抗的作用從而對機(jī)體進(jìn)行整體調(diào)節(jié)，其化學(xué)成分并不等同于單味藥化學(xué)成分的簡單相加多靶點(diǎn)、多途徑、整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢使腦心通在AS防治上具有廣闊的應(yīng)用前景，但其分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討討論現(xiàn)代動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均已證實(shí)，腦心通具有降脂、緩解心絞23結(jié)論

阿托伐他汀和腦心通均具有抑制ox-LDL刺激下體外培養(yǎng)的VSMcS增