黃海膽對(duì)不同形態(tài)組織抗氧化酶系統(tǒng)的毒性

黃海膽對(duì)不同形態(tài)組織抗氧化酶系統(tǒng)的毒性

隨著世界一體化的趨勢(shì)越來(lái)越強(qiáng)，中國(guó)在國(guó)外的經(jīng)貿(mào)貿(mào)易更加頻繁。由于降低成本、長(zhǎng)距離運(yùn)輸和高運(yùn)輸噸位等優(yōu)點(diǎn)，水陸運(yùn)輸業(yè)已成為主要交通工具。因此，沿海地區(qū)的船舶運(yùn)輸業(yè)非常繁榮。用燃料油占燃料油市場(chǎng)的主導(dǎo)地位。目前,已有大量關(guān)于石油烴對(duì)海洋中藻類、浮游微生物、魚類、甲殼類等海洋生物的毒性效應(yīng)影響研究1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1s的生理性狀的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)選用將黃海膽(GlyptocidarisCrenularis)置于室溫(13±2)℃、鹽度31.4的實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)3個(gè)月后,選擇生理性狀正常、反應(yīng)敏捷、狀態(tài)健康、大小一致的海膽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用海膽直徑(5±0.2)cm左右、體重(57.4±3.2)g、30個(gè)月齡左右。1.1.2試驗(yàn)對(duì)象的石油本實(shí)驗(yàn)選用180本實(shí)驗(yàn)選用GM-2型消油劑作為實(shí)驗(yàn)消油劑,購(gòu)自青島光明環(huán)保技術(shù)有限公司。1.1.3試驗(yàn)儀器及儀器JY92-Ⅱ型細(xì)胞破碎儀、微型離心機(jī)(BeckmanMicrofuge18)、冷凍臺(tái)式離心機(jī)(ThermoFisher)、酶標(biāo)儀、基因研究型超純水機(jī)(FJY2002-UVF-P)、DK-8D型電熱恒溫水浴鍋、FA1004型電子天平、JDS-109U紅外測(cè)油儀、JB-3型磁力攪拌器、BeckmanJ2-MC型高速冷凍離心機(jī)、HH-S水浴鍋等。1.1.4抗氧化酶活性測(cè)定無(wú)水乙醇(分析純)、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)、抗氧化酶活性測(cè)試試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)、NaCl(分析純)、CCl1.2試驗(yàn)溶液的制備1.2.1180#燃料油wafs市政acc的制備將1801.2.2180#燃料油cewafsch物理能源壓力探測(cè)器的制備將180以上受試液制備均為預(yù)實(shí)驗(yàn)所用,油水配比濃度可按實(shí)驗(yàn)具體要求改變。1.2.3-2型消油劑的制備在2L海水中加入油品質(zhì)量20%的GM-2型消油劑,按照上述方法與上述2種受試液一同攪拌24h后,靜置6h,分離下層水相,置于4℃環(huán)境中避光貯存待用。1.2.4試驗(yàn)的濃度梯度調(diào)整根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的96h-EC1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1消油劑為單一溶劑暴露期分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組包括WAFs組和CEWAFs組,將18只黃海膽置于32cm×16.5cm×24cm玻璃缸中,暴露在根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的0.3125,0.625,1.25,2.5和5g/L五組質(zhì)量濃度WAFs和CEWAFs(總體積為2L)中培養(yǎng)。對(duì)照組為海水空白對(duì)照和消油劑空白對(duì)照,按照最佳分散比例,消油劑對(duì)照組受試液2L海水中加入2g消油劑;海水對(duì)照組即受試液僅為2L海水。進(jìn)行24h更換一次受試液的半靜態(tài)暴露,96h后,從容器中隨機(jī)選取3只海膽用于實(shí)驗(yàn)。1.3.2恢復(fù)實(shí)驗(yàn)暴露期后只用2L海水培養(yǎng),24h換1次水,7d后按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.3.3超聲粉碎機(jī)法取各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中海膽部分腸和性腺組織,在4℃生理鹽水(0.86%)中漂洗,用濾紙拭干后,置于10mL小燒杯中,稱重并記錄。向小燒杯中加入2/3體積的質(zhì)量為組織樣品9倍的生理鹽水,用醫(yī)用剪刀盡快剪碎組織,整個(gè)過(guò)程應(yīng)將小燒杯置于冰水中進(jìn)行。將超聲粉碎機(jī)的電流調(diào)至400A,超聲時(shí)間為5s/次,間隔10s,重復(fù)5次,即得到組織勻漿。將制備好的10%組織勻漿用低溫高速離心機(jī)在4℃、轉(zhuǎn)速為2000r/min條件下離心10min,取上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.3.4酶活性測(cè)定蛋白含量測(cè)定需按照考馬斯亮藍(lán)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作?？寡趸富钚缘臏y(cè)定參照SOD,CAT,GSH-Px,GST試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。1.4數(shù)據(jù)分析及結(jié)果誘導(dǎo)率計(jì)算公式:式中,Ni為實(shí)驗(yàn)組受誘導(dǎo)后酶活性(含量);N為對(duì)照組酶活性(含量)。各酶活性的計(jì)算公式均根據(jù)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS19.0數(shù)據(jù)分析軟件,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。當(dāng)0.01≤p≤0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著,p≤0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。2結(jié)果與分析2.1不同部位油調(diào)素對(duì)gsh酶活性的影響暴露在油水配比質(zhì)量濃度分別為0.3125,0.625,1.25,2.5和5g/L的燃料油WAFs和CEWAFs中96h的黃海膽,其腸和性腺組織中CAT、SOD、GST酶活性及GSH含量不僅實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著,而且各實(shí)驗(yàn)組間亦存在顯著差異,圖1~圖4可清晰反映出2種暴露液對(duì)黃海膽腸和性腺組織中抗氧化酶活性的影響。由圖1可知,黃海膽經(jīng)不同質(zhì)量濃度的WAFs和CEWAFs暴露96h后,其腸和性腺組織的CAT酶活性變化趨勢(shì)大致相同,均先升高后降低。質(zhì)量濃度為0.625g/L到1.25g/L時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著差異,說(shuō)明暴露液對(duì)CAT酶活性誘導(dǎo)作用顯著。當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度為1.25g/L時(shí),腸和性腺的CAT酶活性達(dá)到最大誘導(dǎo)值,即在WAFs和CEWAFs中分別為120.72,103.19U/mgprot和123.02,114.14U/mgprot。由圖2可知,實(shí)驗(yàn)組腸和性腺組織SOD酶活性明顯高于對(duì)照組,說(shuō)明WAFs和CEWAFs對(duì)SOD顯著誘導(dǎo)。而酶活性總體呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì),說(shuō)明一定質(zhì)量濃度時(shí)誘導(dǎo)作用減弱,出現(xiàn)抑制效應(yīng)。WAFs組油水配比質(zhì)量濃度為2.5g/L時(shí),SOD酶活性出現(xiàn)最大誘導(dǎo)值,腸為113.06U/mgprot、性腺為113.67U/mgprot;而CEWAFs組,油水配比質(zhì)量濃度為1.25g/L時(shí),SOD酶活性達(dá)到最大誘導(dǎo)值,腸和性腺分別為119.57,116.95U/mgprot。由圖3可知,暴露期黃海膽腸和性腺組織的GST酶活性均隨著WAFs和CEWAFs質(zhì)量濃度的升高先增大后減小。當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度0.3125g/L時(shí)各組織GST酶活性均WAFs組低于CEWAFs組,說(shuō)明此質(zhì)量濃度時(shí)CEWAFs組對(duì)GST酶活性誘導(dǎo)強(qiáng)度大于WAFs。而油水配比質(zhì)量濃度5g/L時(shí),情況則相反。當(dāng)油水配比濃度為2.5g/L時(shí),暴露在WAFs中的海膽腸和性腺中GST酶活性均最大,即最大誘導(dǎo)值為127.82,128.46U/mgprot;而油水配比濃度為1.25g/L時(shí),CEWAFs中海膽腸和性腺中GST酶活性均最大,最大誘導(dǎo)值為140.19,134.13U/mgprot。由圖4可知,當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度為0.3125g/L時(shí),腸和性腺組織中GSH含量均略有上升,說(shuō)明2種暴露液對(duì)GSH酶含量的誘導(dǎo)作用較弱。隨著油水配比質(zhì)量濃度的升高,GSH含量增加,說(shuō)明2種受試液對(duì)GSH酶活性誘導(dǎo)效應(yīng)增強(qiáng)。達(dá)到最大值后酶活下降,發(fā)生抑制作用。當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度為1.25g/L時(shí),暴露在WAFs和CEWAFs中的黃海膽腸和性腺GSH含量均達(dá)到最大誘導(dǎo)值,即腸中分別為178.67,191.03μmol/L,性腺中分別為170.81,187.97μmol/L。而且相鄰濃度組之間基本上存在極顯著差異。由表2可見,WAFs組油水配比質(zhì)量濃度為2.5g/L時(shí),腸和性腺組織中的SOD和GST均達(dá)到最大誘導(dǎo)率,即該質(zhì)量濃度對(duì)SOD和GST酶活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng);而CEWAFs組油水配比質(zhì)量濃度在1.25g/L時(shí)對(duì)CAT,SOD,GST,GSH酶活性誘導(dǎo)強(qiáng)度最大。從最大誘導(dǎo)率來(lái)看,無(wú)論是腸還是性腺,SOD和CAT均為最大,可以說(shuō)明二者對(duì)暴露液的誘導(dǎo)作用敏感度最高。2.2不同油調(diào)劑配比海膽腸和陰道組織sod酶活性的變化經(jīng)過(guò)7d恢復(fù)期,海膽腸和性腺中CAT,SOD和GST酶活性和GSH含量變化趨勢(shì)與暴露期大體一致,如圖5~圖8。由圖5可見,恢復(fù)期的黃海膽腸和性腺組織的CAT酶活性發(fā)生了顯著變化,相鄰質(zhì)量濃度組之間表現(xiàn)出極顯著差異,變化趨勢(shì)隨著暴露期油水配比質(zhì)量濃度的增加呈先增加后降低?；謴?fù)期同暴露期相比,實(shí)驗(yàn)組的酶活性均有所降低,說(shuō)明活性有所恢復(fù)。暴露在WAFs和CEWAFs中的黃海膽均在恢復(fù)期油水配比質(zhì)量濃度為1.25g/L時(shí)腸和性腺組織的CAT酶活性最大,腸中最大誘導(dǎo)值WAFs組為111.98U/mg-prot、CEWAFs組為99.68U/mgprot,性腺中最大誘導(dǎo)值WAFs組為115.84U/mgprot,CEWAFs組為101.31U/mgprot。經(jīng)過(guò)7d恢復(fù)期,黃海膽腸和性腺中SOD酶活性同暴露期相比,對(duì)應(yīng)油水配比質(zhì)量濃度下的SOD酶活性與對(duì)照組差異性減弱,隨著WAFs和CEWAFs質(zhì)量濃度的增大酶活性仍呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),但變化程度減小。海膽腸和性腺組織SOD酶活性最大誘導(dǎo)值出現(xiàn)在質(zhì)量濃度為2.5g/LWAFs組,即109.47,109.06U/mgprot。CEWAFs組腸和性腺組織的SOD酶活性達(dá)到最大誘導(dǎo)值的油水配比質(zhì)量濃度為1.25g/L,即112.33,108.70U/mgprot(圖6)。當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度為0.3125g/L時(shí),性腺組織中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)顯著差異,油水配比質(zhì)量濃度為0.625,1.25和2.5g/L時(shí),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均呈現(xiàn)極顯著差異,而且相鄰濃度組之間亦差異顯著,腸組織中GST酶活性的差異形態(tài)與性腺組織基本一致。與暴露期WAFs和CEWAFs油水配比質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的腸和性腺中GST酶活性均隨著配比質(zhì)量濃度的增大出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),而這種變化程度和暴露期相比較小,最大誘導(dǎo)值也下降,暴露期WAFs和CEWAFs中腸組織的GST酶活性最大誘導(dǎo)值分別為132.26U/mgprot和140.19U/mgprot;恢復(fù)期對(duì)應(yīng)WAFs和CEWAFs中腸組織的GST酶活性最大誘導(dǎo)值分別為125.04U/mgprot和131.29U/mgprot(圖7)。如圖8所示,和暴露期相比,經(jīng)過(guò)7d恢復(fù)腸和性腺中試驗(yàn)組GSH的含量有不同程度的降低,隨著油水配比質(zhì)量濃度的增大,含量出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì),但變化程度明顯下降。當(dāng)油水配比質(zhì)量濃度為0.3125,0.625,1.25和2.5g/L時(shí),試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的GSH含量呈現(xiàn)顯著差異,相鄰濃度組之間亦表現(xiàn)顯著差異。在油水配比質(zhì)量濃度為1.25g/L時(shí),腸中GSH含量在WAFs組和CEWAFs組中均出現(xiàn)最大誘導(dǎo)值,分別為172.90,182.81μmol/L。而性腺中GSH含量在WAFs組和CEWAFs組中亦均出現(xiàn)最大誘導(dǎo)值,分別為166.84,181.35μmol/L。與暴露期相比,最大誘導(dǎo)率均有所下降。但WAFs和CEWAFs組對(duì)各酶活性的最大誘導(dǎo)濃度與暴露期相同。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),WAFs組性腺中SOD酶活性恢復(fù)程度較其他3種酶相比最為顯著,CEWAFs組性腺中CAT和SOD酶活性均顯著恢復(fù)。3抗氧化酶系統(tǒng)劑量-效應(yīng)柱形圖是被采用最頻繁的生物急性毒性研究結(jié)果的反應(yīng)形式在不同質(zhì)量濃度組之間進(jìn)行比較,0.3125,0.625,1.25g/L的CEWAFs對(duì)黃海膽的抗氧化酶誘導(dǎo)作用依次增強(qiáng),達(dá)到最大誘導(dǎo)值后開始減弱,抗氧化酶活性開始下降。而WAFs對(duì)于SOD和GST酶活性最大誘導(dǎo)濃度達(dá)到2.5g/L,CAT和GSH酶活性最大誘導(dǎo)濃度均為1.25g/L。由此說(shuō)明從最大誘導(dǎo)濃度開始,生物體細(xì)胞受損,抗氧化酶系統(tǒng)被破壞。盡管CEWAFs濃度約WAFs的3倍,但CEWAFs組2個(gè)時(shí)期的抗氧化酶活性整體卻并沒有高出WAFs組3倍。這與Milinkovitch等從表2和表3來(lái)看,不同組織之間受WAFs和CEWAFs的誘導(dǎo)影響規(guī)律為,性腺組織大于腸組織。且腸和性腺的SOD和CAT活性對(duì)于暴露液誘導(dǎo)和抑制作用的敏感性較GST和GSH要相對(duì)強(qiáng)一些。余群等GSH是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化劑,其特點(diǎn)是水溶性較強(qiáng)。在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)作用下把HMilinkovitch等4抗氧化酶活性本文探究了1801)暴露后的黃海膽腸和性腺組織中抗氧化酶活性隨著暴露液濃度的增加出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì),說(shuō)明機(jī)體在WAFs和CEWAFs暴露下既可產(chǎn)生適應(yīng)性“毒性興奮”作用,表現(xiàn)為酶活性因受到誘導(dǎo)而升高;也受到抑制