耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界及自然人的皮膚、腸道和呼吸道。這是醫(yī)院感染的主要原因之一。近年來,隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用,該菌對此類藥物的耐藥率一直處于高位水平1材料和方法1.1材料表面1.1.1痰液、瞳液、引流液收集2013年我院住院患者送檢的CRPA菌株104株。標(biāo)本來自于痰液、尿液、引流液等。剔除同一患者的重復(fù)菌株。入選標(biāo)準(zhǔn):紙片法抑菌圈直徑亞胺培南≤15mm或美羅培南≤15mm,兩者只要其中一種符合上述范圍。鑒定采用法國生物梅里埃公司API20NE鑒定條。1.1.2抗癲癇藥物除替卡西林為大連美侖生物技術(shù)有限公司制品外,其余測試抗菌藥物均購自于中國藥品生物制品檢定所。1.1.3一般培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基購自于英國OXOID公司;內(nèi)切酶SpeI、濃度為20mg/mL的蛋白酶K購自TaKaRa公司。1.2方法1.2.1mic操作及結(jié)果判讀采用瓊脂倍比稀釋法檢測藥物的最低抑菌濃度(MIC),操作及結(jié)果判讀按照2013版CLSI標(biāo)準(zhǔn)。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC35218。1.2.2凝膠電泳檢測(1)細(xì)菌DNA原位純化:將細(xì)菌與等體積1%低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻后注模,成型凝膠塊經(jīng)蛋白酶K溶液裂解、已滅菌的蒸餾水及TE液多次洗滌,置于4℃過夜。(2)限制性內(nèi)切酶原位消化:將原位純化的凝膠塊切成一定大小薄片,加入120μL酶切體系(內(nèi)切酶SpeI)37℃孵育3h。(3)加樣:把消化好的膠塊及標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812置于膠梳板上,把梳子放入膠槽中,用0.5×TBE液配制1%Goldenagarose澆制電泳膠,室溫下凝固30min左右。凝固后用融化的自身膠或低熔點(diǎn)膠封閉加樣孔。(4)電泳參數(shù):6V/cm,19h,角度變換120°,轉(zhuǎn)換時(shí)間為2.16~54.17s。(5)染色及圖像采集:電泳結(jié)束后,EB染色。采用凝膠成像系統(tǒng)(Bio.Rad)采集凝膠DNA指紋圖像。判讀標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)一致1.2.3數(shù)據(jù)分析2結(jié)果2.1crpa的臨床流行2.1.1患者性別與年齡的分析分離104株CRPA的患者年齡在19~99歲,平均58歲,其中50歲以上的患者占65.4%(68/104),19~50歲患者占34.6%(36/104)。2.1.3分離株為5.9%、引流液5.2.3%、管液5.9%;104株CRPA中分離自呼吸道標(biāo)本88株(85.6%)、腹腔引流液8株(7.7%)、尿液2株(1.9%)、血液2株(1.9%)、組織2株(1.9%)、膽汁1株(1.0%)、分泌物1株(1.0%)。2.2耐藥率的耐藥情況104株CRPA對美羅培南、亞胺培南的耐藥率分別為85.6%、98.1%,對阿米卡星、慶大霉素的耐藥率分別為18.3%、40.4%,對頭孢他啶和頭孢吡肟的耐藥率分別為26.9%和21.2%。對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為44.2%和50.0%。對哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦和替卡西林-克拉維酸的耐藥率分別為19.2%、26.9%和52.9%。對氨曲南耐藥率為26.9%。對黏菌素耐藥率最低,僅為5.8%。見表1。2.3pfge圖譜和克隆a分析采用PFGE對CRPA進(jìn)行同源性分析,并用Bionumerisc軟件對其PFGE圖譜進(jìn)行聚類分析,結(jié)果顯示PFGE圖譜相似值為16.8%~99.6%,共存在48個(gè)型別(3株未能分型),9個(gè)克隆。克隆A為優(yōu)勢流行株,占41.6%(42/101),主要集中在我院的神經(jīng)外科、老年科及綜合病房,見圖1;次之為克隆B,占5.9%(6/101),見圖2?？寺、克隆I各2株,各占2.0%(2/101)。3crpa的感染銅綠假單胞菌是需氧不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌,是一種重要的條件致病菌。目前,世界各地陸續(xù)出現(xiàn)了該菌耐碳青霉烯類藥物的報(bào)道細(xì)菌同源性分析的方法有很多,包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增限制性片段長度多態(tài)性分析(AFLP)、重復(fù)序列PCR分析(REP-PCR、ERIC-PCR)、MLST、PFGE等。PFGE具有良好的分辨率、特異性、穩(wěn)定性和結(jié)果可靠性,被譽(yù)為細(xì)菌分子分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,已被眾多國家采用。有研究證實(shí)PFGE比MLST對銅綠假單胞菌的分辨率更高在A型中hsh1268和hsh1340菌株、hsh1117和hsh854菌株具有完全相同PFGE指紋。hsh1268是從1例神經(jīng)外科女性患者的痰液中分離,而hsh1340來自綜合病房,同樣為痰液樣本,這提示可能存在同一克隆株的播散,但是并未發(fā)現(xiàn)除此之外來自神經(jīng)外科患者也有與此完全相同的PFGE分型。hsh1117和hsh854分離自同一時(shí)期的老年病房中相同性別菌株相同來源的患者,從暴露史上分析,這2例患者均有吸痰史,提示2例患者很有可能感染同一菌株,具體原因是暴露于相同環(huán)境,還是患者之間接觸傳染尚不能確定。其次為B型,6株,占5.94%,圖譜相似值為80.3%~97.4%。hsh1033和hsh1319菌株都來自神經(jīng)外科年齡相似患者的痰液標(biāo)本,由于住院時(shí)間不同,因此并不知道患者之間是否存在交叉感染的可能;也有可能是都暴露于相同環(huán)境所導(dǎo)致的相同菌株感染。hsh1208和hsh720菌株具有完全相同PFGE指紋,但來自不同時(shí)期的不同病房,尚不能確定相互之間的關(guān)系。值得注意的是,這些完全同源的菌株科室分布集中,而且菌株與菌株之間檢出時(shí)間跨度不大,皆在3個(gè)月以內(nèi),特別是C型的hsh470和hsh547都來自同一個(gè)月ICU的痰液標(biāo)本,提示可能來源同一菌株,也暴露了ICU在感染的傳播和擴(kuò)散控制上存在一定問題。D型hsh954和hsh976也是來自同一個(gè)月的標(biāo)本,但是菌株來源的患者和科室并不同,其傳播途徑值得進(jìn)一步深入調(diào)查,但可以反映出不同的科室在這個(gè)時(shí)間段的消毒滅菌工作存在缺陷。綜上所述,對于CRPA的感染,應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果合理應(yīng)用抗菌藥物,對于病房的管理應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員的手衛(wèi)生和嚴(yán)格遵守?zé)o菌技術(shù)規(guī)范操作,加強(qiáng)留置醫(yī)療器械的護(hù)理,避免交叉感染。采用WHONET5.4進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及匯總