木霉素的氣相色譜法測定

木霉素的氣相色譜法測定

木霉素可抑制真核生物細(xì)胞（如人類宮頸傳代細(xì)胞和兔子紅血球細(xì)胞）中核糖體中的c-c形成，是蛋白質(zhì)合成抑制劑。國外在20世紀(jì)70年代就開始關(guān)注木霉素在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用,國內(nèi)對(duì)木霉素的研究主要集中在對(duì)植物真菌病害的生物防治。項(xiàng)目組從浙江臨安天目山采集的枸骨中分離篩選到一株活性內(nèi)生真菌,經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定為哈茨木霉菌。對(duì)該內(nèi)生真菌發(fā)酵液活性物質(zhì)的分離、提純和結(jié)構(gòu)鑒定后表明,其主要有效成分為木霉素。有關(guān)木霉素的制備方法以及應(yīng)用等已經(jīng)申請(qǐng)了專利。本實(shí)驗(yàn)利用氣相色譜法對(duì)木霉素的檢測方法進(jìn)行了初步探索。旨在為木霉素的菌種選育、發(fā)酵工藝及分離提取等研究過程中,建立一套快速檢測技術(shù)。1儀器和試劑盒1.1儀器Agilent6890氣相色譜儀,包括自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、氫火焰離子檢測器。1.2試驗(yàn)藥物和試驗(yàn)試劑木霉素對(duì)照品(中國計(jì)量學(xué)院生物安全與食品科學(xué)研究所,純度為99.9%)。甲醇(色譜純)、乙酸乙酯(分析純)。2氣相色譜評(píng)價(jià)的定性方法2.1氫火焰離子檢測色譜柱HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(以5%苯基甲基硅氧烷為固定液,30m×320μm,0.25μm);檢測器:氫火焰離子檢測器(FID),檢測器溫度270℃;進(jìn)樣口溫度250℃;柱溫度:程序升溫,初始溫度100℃,保持5min,以10℃·min-1升溫至260℃保持5min,載氣:氮?dú)?流速1.5mL·min-1;不分流,以甲醇為溶劑。2.2對(duì)照溶液的制備精密稱取木霉素對(duì)照品0.05g,用甲醇配成質(zhì)量濃度為0.5g·L-1的溶液,即得儲(chǔ)備液,備用。2.3乙酸乙酯的制備取含有木霉素的發(fā)酵液1L放入分液漏斗中,加入500mL乙酸乙酯,振蕩下萃取20min,靜置30min后分出乙酸乙酯層,重復(fù)萃取3次,合并乙酸乙酯層。真空濃縮至干,用甲醇洗入100mL容量瓶并用甲醇定容,待測。2.4結(jié)果在“2.1”色譜條件下,將樣品色譜圖與木霉素對(duì)照品色譜圖進(jìn)行對(duì)照,根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行樣品中木霉素定性。對(duì)照品和樣品的氣相色譜圖見圖1。2.5不同的樣品溶液按“2.3”項(xiàng)下操作制備5批不同批號(hào)(20071120,20071125,20071203,20071211,20071220)的樣品溶液,按“2.1”項(xiàng)下條件測定,結(jié)果均檢測出木霉素。3測定固相色譜的定量方法3.1檢測限的確定精密吸取“2.2”對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別稀釋成0.4,0.2,0.1,0.05,0.025,0.01g·L-1的溶液,精密吸取1μL,分別注入氣相色譜儀,以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行線性回歸,回歸方程式為:A=299.46ρ-1.4024,r=0.9999,可見木霉素在0.01～0.5g·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。取對(duì)照品溶液0.1g·L-1按“2.1”項(xiàng)下條件,連續(xù)進(jìn)樣5次,以峰面積計(jì)算精密度,RSD(%)為0.2。分別取3種不同濃度的對(duì)照品適量,加入到一定量已知含量的樣品中,按“2.3”項(xiàng)進(jìn)行處理,得到平均回收率為99.76%,RSD(%)為1.69。結(jié)果見表1。精密量取同一批次的發(fā)酵液7份,按“2.3”項(xiàng)處理測定,測得平均含量為0.138g,RSD(%)為0.35,結(jié)果表明,本法重復(fù)性好。取同一供試品溶液,分別于1,2,3,4,8,24h進(jìn)樣測定,RSD(%)為0.75,表明樣品溶液在24h內(nèi)保持穩(wěn)定。通過逐級(jí)降低質(zhì)量濃度,進(jìn)樣測定,確定木霉素的最小檢測限(S/N=3)為50μg·L-1。按“2.3”項(xiàng)下操作制備5批樣品(批號(hào)同“2.5”)溶液,按外標(biāo)法定量,測定結(jié)果分別為138.8,139.1,138.2,138.6,139.5mg。4每次1000公里本實(shí)驗(yàn)所建方法分離度好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,測定方法簡單、快速、重復(fù)性好,可用于