TSHRH 017-2019《化妝品防腐挑戰(zhàn)試驗》

ICSICS71.100.70C2682Y42化妝品防腐挑戰(zhàn)試驗AntimicrobialEffectivenessTestingofCosmetics準T/SHR04-01實施上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會發(fā)布面言面言 2 33.生物安全措施和防污染措施 3 6.試劑和材料 4 附錄A培養(yǎng)基和試劑 7附錄B常見中和劑參考表 9目次本標本標準按照GB/T1.1-2009給出啜則起草。木標準由上海11用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會提出和歸門。本標準起草單位：上海海關(guān)食品中心、上海家化聯(lián)合股份有限公司、上海東晟源II化有限公司、上海大祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司、上海輕匚業(yè)研充所有限公司、上海H用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會。本標準主要起草人：劉夏、李曉虹、王傳現(xiàn)、曹平、陳園園、陳III、謝坤、王革、李瓊、陳逸君、金堅、陳亦華2刖—a刖—a—舌化妝品防腐挑戰(zhàn)試驗1范圍本部分規(guī)定了化妝品防腐性能的檢測評價方法化妝品防腐挑戰(zhàn)試驗1范圍本部分規(guī)定了化妝品防腐性能的檢測評價方法。木部分適用于液體類、乳液類、膏霜類等常見化妝品的防腐體系性能測試，其他產(chǎn)品也可根據(jù)用途選擇采用。2規(guī)范性引用文件防止污染措施應(yīng)符合GB/T27403的規(guī)定。4術(shù)語和定義4.1防腐挑戰(zhàn)試驗卜.列文件對F本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用』僅所注II期的:直用「本文件。凡是不注II期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用J?本文件?；瘖y品安全技術(shù)規(guī)范(2015版)消毒技術(shù)規(guī)范(2002版)GB/T6682-2008分析實軟宰用水規(guī)格和試臆方法GB19489-2008實驗宰圭物安全通用要求GB4789.28-2013食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求3生物安全措施和防污染措施3.1生物安全措施為了保護實驗宰人員的安全，應(yīng)由具備資格的工作人員進行檢測，所有培養(yǎng)物和廢弁物應(yīng)參照GB19489中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行°3.2防污染措施即微生物挑戰(zhàn)性實驗將一定雖的微生物加入到化妝品中，模擬化妝品中可能出現(xiàn)的污染情況，何隔一定時間對其中的活菌量進行檢測，以活菌增減量判斷化妝品防腐體系效能的實驗方法，和劑(neutralizer)在微生物殺滅試驗中，用以消除試驗微生物與殺菌劑的混懸液中和微生物表面上殘留的殺菌劑，使其失去對微生物抑制和殺滅作用的試劑。指中和劑與殺菌劑作用后的產(chǎn)物。5儀器和設(shè)備5.2移液器：量程OELlOpL：最程10glz^lOO|iL：最程100pI^1000四L及無菌吸頭。5.3無菌吸管，10.0i?L(具0.1niL刻度)或移液器及吸頭。5.5顯微鏡：5.6三角瓶(200mL)；5.9電子大平。5.10生物安全柜。35.5.11計時器。5.12比濁儀。5.13渦旋振蕩器°6試劑和材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析務(wù)L或生化試劑。6.1實驗用水：應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。6.2磷酸鹽緩沖液(PBS):0.03nnnol/L.pH8.0.見附錄A.16.3營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A.2。6.4沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA):見附錄A.36.5EugonLT100肉湯：見附錄A.4。6.6D/E中和肉湯(Dey/Eii§ky中和肉湯)：見附錄A.5一6.7改足Lethecn肉湯：見附錄A.66.8胰蛋白腺大豆瓊脂(TSA):見附錄A.7,6.9試臉菌株：金黃色葡篇球菌(ATCC6538)、大腸埃希氏菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC15442)、白色假統(tǒng)酵母菌(ATCC10231)、黑曲霉菌(ATCC16404)。7操作步驟7.1菌液制備7.1.1白色假絲酵母菌菌液的制備：從保存好的試管斜面上(或商種保存管中)取適量的菌體或菌種吸附小磁珠接種于沙氏葡葡糖瓊脂斜面，28UC±2°C,培養(yǎng)18-24h.用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)物，劃線接種JSDA平板,28C±2C,培養(yǎng)18-24ho挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，劃線接種JSDA瓊脂斜面,28C±2C,培#18-24h,即為第3代培養(yǎng)物■吸取適量的無菌IBS緩沖液加入斜血試管內(nèi)，反復(fù)吹洗，洗下菌苔。將洗液轉(zhuǎn)移至另一無菌試管中,渦旋混勻20&用PBS緩沖液將其稀釋成約1.0X106cfti/niL^1.0X107cfiiAiiL的菌懸液。制備好的菌懸液應(yīng)在2h內(nèi)使用，或在：2°C~8°C保存不超過24h；7.1.2銅綠假單胞南'金黃色葡荷球菌\大腸桿南南液的制備：從保存好的試管斜面上(或菌種保存管中).1代培養(yǎng)物，劃線接種JTSA平板，36C-1C°C,培?18-24ho挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，劃線接種于ISA瓊脂斜面，36C士1CC,培養(yǎng)18-24h,即為第3代培養(yǎng)物。吸取適量的無菌生理鹽水加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹洗，洗下菌苔。將洗液轉(zhuǎn)移至另一無菌試管中，渦旋混勻20s。用無窗生理鹽水將其稀樺成約1.0X107cfivm~1.0X108chi/mLL的菌懸液＜=制備好的I莉懸液應(yīng)在2h內(nèi)使用，或在2C8C保存不超過24h°7.1.3黑曲卜抱子懸液的制備：從保存好的試管斜面上(或菌種保有取適量的菌體或菌種吸附小關(guān)接種于馬鈴薯葡茍?zhí)黔傊泵妫?2.5C±2.5°C,培養(yǎng)7d-lld吸取適量的無菌0.05*/可吐溫80生理鹽水加入斜面試管內(nèi)，刮洗黑曲客分生弛子于溶液中。將抱子懸液轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的無菌上角瓶中，輕輕振搖Inin后,用無菌玻璃棉過濾除去菌絲。過濾后,顯微鏡下(400倍)觀察懸液中是否存在菌統(tǒng)，若懸液中有菌統(tǒng)存在，可經(jīng)2000g,離心20n血除去菌稅。再次在顯微鏡下觀察，若仍仃聞#存在:，冶rjjq心閏0.05%(v/v)吐溫80生理鹽水將其桶祥成1.0x106cfti/niL-l.OX107cfiiAnL的泡子懸液。制備好的山子懸液應(yīng)當天使用;或在23C保存不超過2d,使用前混合均勻并在顯微鏡下觀察是否有飽子出芽，若有抱子出芽，則棄之不用。7.2中和劑鑒定試驗7.2.1每種試驗菌株的中和劑鑒定試驗應(yīng)分別進行.7.2.2化學(xué)中和劑的選擇：為了中和化妝品中的防腐劑，多采用D成中和肉湯、EugonLT100液體培養(yǎng)基或者改度LETHEEN肉湯-若中和效果不理想，可根據(jù)產(chǎn)品中添加的防腐劑類型，參考附錄B進行選擇。7.2.3化學(xué)中和劑鑒定流程7.2.3.1將7.1中準備的菌液10倍系列稀釋至濃度為IX10scfu/mL的菌懸液，用F中和鑒定試驗。477.2.3.2將1g或1mL樣品加入到9mL中和劑中，徹底混勻，室溫作用30±15min,制成中和產(chǎn)物：若中和效果不理想,可用中和劑作為稀釋液進行二次倍比稀祥。將1mL秘懺液(PBS)加入到9mL中和劑中，徹底混勻,室溫作用30±15min,作為對照組。7.2.3.3分別接種1mL7.23.1中制備的陶夜至測試管(含10mL中和產(chǎn)物)和對照管中，渦旋混勻。同時接種1mL7.23.1中制備的菌液至10mL稀釋液(PBS)中，作為陽性對照組。7.2.3.1分別對測試組、對照組和陽性對照組進行平板計數(shù),/個稀稈度進行雙平行實隱細菌培養(yǎng)基7.2.3.5對各組進行汁數(shù)，測試組計數(shù)結(jié)果記作Nvf,對照組計數(shù)結(jié)果記作Nvn,陽性對照組計數(shù)結(jié)果記作Nv：q1Nvn接近Nv,并且NvfNO.5Nvn時，認為中和劑有效。7.2.1其余中和方法:除化學(xué)中和劑方法外，還可采用稀釋法、過濾沖洗法對產(chǎn)品中殘留的防腐劑進行償活菌回收率靈敏度的降低，以避免假陰性結(jié)果(例如，可采用膜過濾il數(shù)法代替稀祥液平板計數(shù)法)。7.3挑戰(zhàn)試驗7.3.1符種試軟菌株的殺菌試矣應(yīng)分別進行。7.3.2挑戰(zhàn)試驗而應(yīng)該先按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)第五章第2節(jié)“菌落總數(shù)檢驗方法”對樣品進行“菌落總數(shù)”檢測。7.3.3接種：取0.2mL7.1中制備的菌液,加入到裝有20g或20ml樣品的無菌塑料瓶中,徹底混合均勻。接種后的樣品置于22.5°C±2.5C培養(yǎng)，寡別在7,14,28天計數(shù),分別計作Nx(X=7,M,28)。7.3.4計數(shù)：培祥至:特定時間后(「，14,21,28天)，取1mL或1g接種后的樣品，加入含有9mL無商中和劑的試管中,充分渦旋混勻。(若中和劑鑒定試驗中，對樣品進行百倍稀4iter中和劑的什段性,則接種后的樣品進行計數(shù)時也應(yīng)進行百倍稀科.與中和劑作用30±15min后，分別吸取1.0mL樣液于2個無菌至皿中連行平板計數(shù)。如平板上生長菌落數(shù)較多,可進行10倍系列稀釋,選擇合適的稀移度進行平板計數(shù)。何個稀祥度至少進行雙平行汁數(shù)。黑曲客菌在22.5°C±2.5°C培養(yǎng)3-5d：銅綠假單胞卸金黃色葡篇球菌'大腸桿菌和白色假幼.酵件菌在32.5C±2.5C培養(yǎng)48-72he7.3.5選取菌落數(shù)在30-300efu(細菌和白色假稅酵母菌)或者15-150efu(黑曲客)的平板進行汁數(shù)，并按照Nx=C/(Vd)計算樣品中的活菌濃度(C代表計數(shù)平板E的菌落平均數(shù)：V代表襯II上的加菌樣品接種量，一?般為1mL：d代表計數(shù)平板對應(yīng)的稀釋倍數(shù)]7.3.5除大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡荷球菌、白色念珠菌、黑曲霉外，還可根據(jù)產(chǎn)品具體情況，增加特定的試與僉菌，該試駁藺可以代表產(chǎn)品最可能受到的生物污染；比如，在高糖分門服制劑(口腔用品)的防腐挑戰(zhàn)試騷中，推薦增加魯氏接合酵母NCYC381,8結(jié)果判斷參考表1對產(chǎn)品進行防腐效果評價。5價標準減少值Rx(Rx=lgN0-lgNx)a6菌種菌種細菌白色假絲酵母菌測試時間T7T14T28T7T14T28標準A>3>3且>3且>1>1且>1且NIbNIbNIbNIb標準B/>3>3且/NIb>1>1且NIbb：NI表示Nx與前一?測試時間點相比未增長。c：當1gN0=lgNx,且Nx與初始濃度No相比未增長時，Rx=OoT14>OCT28>1且NIb>0且NIb制法：除制法：除瓊脂外其他成分溶解「蒸餉水中，調(diào)pH至7.2~7.4,然后加入瓊脂，加熱溶解，分裝；12FC高壓蒸汽滅菌15min后備用。A.3沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)制法：JIJ「00ml蒸飼水將瓊脂溶解，300m水將葡荷糖與茉白豚溶解，混合卜.述兩部分，調(diào)pH至5.6±0.2,搖勻后分裝，115C壓力蒸汽滅菌15min：使用前，用過濾除菌方法加入0.1g/L的氯霹素或者0.03g/L的鏈霉素。A.4.1制備大豆粉木瓜醉消化物5.0gL0.7g氯化鈉4.0g5.0g1.0g1000.Ont制法：將上還各成分，吐溫80,辛苯聚醇一9以及卵磷脂依次加入到沸水中煮沸至完全溶解。待溶液冷卻后，調(diào)節(jié)pH至二。士0.2,將培養(yǎng)基分裝至合適容器中，「121°C高壓滅商15minA.10.03mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)A.1.1制備稱取無水磷酸氫?.鈉2.83g.磷酸.氫鉀1.36g,加蒸飼水1000mL,待完全溶解后，調(diào)pH至7.2?7.4121C高壓蒸汽滅菌15niinA.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基附錄A(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑7A備A備蛋白豚牛肉育氯化鈉瓊脂蒸餉水15.0g-20.0g1000mLA.3.1制備蛋白豚葡荷糖瓊脂蒸餉水1000mLA.5DZE中和肉湯(A.5DZE中和肉湯(Dcy/Englcy中和肉湯)7.0g硫代硫酸鈉6.0g吐溫80酪蛋白胰酶消化物亞硫酸氫鈉2.5g酵母抽提物2.5g硫代乙酸鈉0.02g蒸ta水制法：將上述各成分或脫水完全培養(yǎng)基依次加入水中加熱至完全溶解，待溶液冷卻后.調(diào)節(jié)pH令7.0±0.2,將培養(yǎng)基分裝至合適容器中,J121C高壓滅菌15min。A.5.1制備制法：將吐溫80以及卵磷脂依次加入到沸水中煮沸至完全溶解，加熱時混合其他成分溶解，輕輕混勻，避免泡沫。待溶液冷卻后，調(diào)節(jié)pH至7.2土0.2,將培養(yǎng)基分裝至合適容器中，F(xiàn)121C高壓滅南15min3A.7胰酪豚大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)A.7.1制備制法：除瓊脂外其他成「蒸⑶水中，調(diào)pH-^7.2-7.1,加入瓊脂，加熱溶解，分裝：12VC滅菌15min后備用。8A.6A.6.1制備肉類胃蛋白酶消化物酪蛋白胰酶消化物吐溫80氯化鈉亞硫酸狙鈉蒸餉水20.0g5.0g5.0g2.0g0.7g5.0g5.0g酪蛋白胰醵消化物大豆粉木瓜恤消化物氯化鈉情水5.0g5.0g甲酸生成削甲酸生成削的酸，lg/L此況.90,30富L+皇素，30g/L+L.ffl筋敢，lg/L+L?拳購教，1&LD/E中和肉湯JSDCLP液體培養(yǎng)是h.洗滌削：吐溫.80,3歲L+L?組筮酸，05g/L領(lǐng)化荊球硫物中和禮硫代硫齡1，5g/L洗滌削：硫代硫酸虬