蝦夷扇貝家系遺傳多樣性分析

蝦夷扇貝家系遺傳多樣性分析

0微衛(wèi)星分子標(biāo)記在蝦夷貝群體多樣性分析中的應(yīng)用本生是屬于冷水性雙殼類的。它廣泛分布在日本、俄羅斯遠(yuǎn)東和朝鮮水域。它獨(dú)特的個(gè)體規(guī)模、快速生長(zhǎng)、口感和抗病性也很好。其閉殼肌肥大,并且含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),干貝氨基酸含量高達(dá)88.3%,明顯高于其他的扇貝種類。20世紀(jì)80年代初,遼寧省水產(chǎn)科學(xué)研究院從日本青森縣陸澳灣引入中國(guó)并展開規(guī)?；B(yǎng)殖。目前已經(jīng)在中國(guó)的黃海北部形成規(guī)模化和產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖,獲得很高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。但是由于近幾年蝦夷扇貝的養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大、環(huán)境污染、生產(chǎn)過程中全人工苗種生產(chǎn)、近交、盲目引種雜交等因素造成了蝦夷扇貝種質(zhì)資源的退化,嚴(yán)重威脅了蝦夷扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此,對(duì)于蝦夷扇貝養(yǎng)殖行業(yè)來說,獲得具有良好經(jīng)濟(jì)性狀和抗病能力的良種是迫切需要解決的問題,而在對(duì)蝦夷扇貝進(jìn)行遺傳改良之前,有必要對(duì)其群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究,以此來指導(dǎo)蝦夷扇貝的育種工作。微衛(wèi)星是基因組上隨機(jī)重復(fù)的核苷酸序列,由于微衛(wèi)星具有共顯性遺傳、快速方便檢測(cè)、多態(tài)信息含量高等優(yōu)點(diǎn),近幾年被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物標(biāo)記輔助選育、種群遺傳分析、基因圖譜構(gòu)建等方面的研究。例如:吳滟等采用30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了同池養(yǎng)殖的長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹群體,結(jié)果篩選出了一些與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記;孫新等選用35個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)鏡鯉一個(gè)繁殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)及經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行了相關(guān)性分析;魯雙慶等采用微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)4個(gè)鯽魚群體遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行了研究。相對(duì)于其他水產(chǎn)動(dòng)物而言,蝦夷扇貝在此方面的研究相對(duì)落后。目前只有劉衛(wèi)東與Li等用第一代標(biāo)記AFLP為主構(gòu)建了蝦夷扇貝遺傳連鎖圖譜,由于缺乏共顯性的標(biāo)記,無法進(jìn)行圖譜整合和比較圖譜的研究,因此以AFLP標(biāo)記為主建立的圖譜應(yīng)用有限,而關(guān)于蝦夷扇貝的QTL定位還未見報(bào)道。常亞青等通過用微衛(wèi)星技術(shù)分析了5個(gè)不同地域的蝦夷扇貝群體的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)這些群體均處于不同程度的雜合子缺失狀態(tài),說明群體的遺傳分化程度比較高,張婧等分析了微衛(wèi)星分子標(biāo)記與蝦夷扇貝家系群體的殼色及生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)是在之前研究的基礎(chǔ)上,利用新的微衛(wèi)星位點(diǎn)來分析蝦夷扇貝群體的遺傳結(jié)構(gòu)并篩選與蝦夷扇貝生長(zhǎng)相關(guān)的標(biāo)記,以此來進(jìn)一步了解蝦夷扇貝的群體遺傳結(jié)構(gòu),豐富與蝦夷扇貝經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的功能基因的標(biāo)記,為蝦夷扇貝遺傳連鎖圖譜的建立和QTL定位研究提供參考,從而加快高密度的遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建進(jìn)程、增加基因組覆蓋率和完善蝦夷扇貝QTL定位研究,最終實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種。1材料和方法1.1家系群體的篩選蝦夷扇貝群體是以中國(guó)大連獐子島的蝦夷扇貝為父本、日本青森縣陸奧灣蝦夷扇貝為母本交配產(chǎn)生的F1代,由本實(shí)驗(yàn)室自行育苗且在遼寧大連獐子島浮筏養(yǎng)殖一年半后長(zhǎng)成的群體。從這個(gè)家系群體中隨機(jī)取90枚蝦夷扇貝個(gè)體,進(jìn)行表型(體重、殼長(zhǎng)、殼高、殼寬)和基因型分析。本實(shí)驗(yàn)的材料取自實(shí)驗(yàn)室自行繁育的蝦夷扇貝家系群體,一方面可以保證實(shí)驗(yàn)材料來源的精確性;另一方面可以確保所有實(shí)驗(yàn)樣品均為同批培育的扇貝。1.2微衛(wèi)星序列及引物的合成本研究使用的19個(gè)蝦夷扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記序列,是取自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中含有微衛(wèi)星的序列,通過Prime5.0設(shè)計(jì)引物,并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;Marker購(gòu)自上海寶生物工程有限公司,分子量標(biāo)準(zhǔn)DL50。1.3pcr擴(kuò)增檢測(cè)板pcr擴(kuò)增采用傳統(tǒng)的苯酚氯仿法提取扇貝得基因組DNA,參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》,提取的DNA經(jīng)純化后定量至100μg/μL。PCR反應(yīng)體系為25μL:DNA模板1μL、10×buffer15μL、Mg2+(25mmol/L)1μL,dNTPs(2mmol/L)1μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、TaqDNA聚合酶1μL,ddH2o4.8μL。在PCR儀上完成擴(kuò)增反應(yīng),PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃30s,退火30s,72℃30s,28個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),1%的硝酸銀染色,凝膠在掃描儀上成像,拍照保存后對(duì)電泳譜帶進(jìn)行分析。1.4統(tǒng)計(jì)分析1.4.1雜合度與多態(tài)信息含量采用PopGene(Verion3.2)軟件統(tǒng)計(jì)微衛(wèi)星基因座的等位基因數(shù)(observednumberofalleles,Na)、有效等位基因數(shù)(Effectivenumberofalleles,Ne),等位基因頻率(Allelefrequency,P),群體觀測(cè)雜合度(observedheterozygosity,Ho)、期望雜合度(expectedheterozygosity,He),多態(tài)信息含量(PolymorphismInformationContent,PIC)值觀察雜合度:Ho=雜合子觀察數(shù)/觀察個(gè)體綜述;期望雜合度:He=1-∑Pi2,Pi為該位點(diǎn)上第i個(gè)等位基因的頻率。根據(jù)Botstein等的公式計(jì)算出多態(tài)信息含量PIC值。其中,n為某一位點(diǎn)上的等位基因數(shù),Pi為第i個(gè)等位基因在群體中的頻率,Pj為第j個(gè)等位基因在群體中的頻率,j=i+1。1.4.2微衛(wèi)星標(biāo)記與各種表型性能的相關(guān)分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的蝦夷扇貝表型數(shù)據(jù),采用SPSS16.0對(duì)蝦夷扇貝生長(zhǎng)性狀與19個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行最小二乘分析。2結(jié)果與分析2.1pcr擴(kuò)增結(jié)果19個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),其擴(kuò)增的條帶清晰、結(jié)果穩(wěn)定,圖1為部分引物在群體中擴(kuò)增的條帶。2.2測(cè)雜合度、多態(tài)信息含量19個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在群體中共檢測(cè)到了60個(gè)等位基因,每個(gè)座位檢測(cè)到的等位基因數(shù)2~4個(gè),等位基因片段大小在113~312bp之間;有效等位基因數(shù)在1.4896~3.9807之間,平均值為3.0175;觀測(cè)雜合度在0~0.7368之間,平均值為0.2952;期望雜合度在0.3307~0.7526之間,平均值為0.6352;多態(tài)信息含量(PIC)在0.2747~0.7017之間,平均值為0.5671(PIC>0.5)。一般認(rèn)為,在某一群體中,當(dāng)PIC>0.5時(shí)該位點(diǎn)表現(xiàn)為高度多態(tài),0.25<PIC<0.5時(shí)該位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài),當(dāng)PIC<0.25時(shí)該位點(diǎn)表現(xiàn)為低度多態(tài)。這表明19個(gè)位點(diǎn)大部分在群體中表現(xiàn)出高度多態(tài),并且在基因組中所含的信息量豐富、分布均勻?？ǚ綑z驗(yàn)Hardy-weinberg平衡結(jié)果表明,19個(gè)位點(diǎn)只有3個(gè)處于平衡狀態(tài)(P>0.01),其余位點(diǎn)都發(fā)生了不同程度的偏離,部分統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),見表1。2.3不同基因型的觀測(cè)值采用最小二乘法對(duì)微衛(wèi)星座位與蝦夷扇貝體重、殼長(zhǎng)、殼高、殼寬進(jìn)行連鎖顯著性檢驗(yàn),見表2。結(jié)果表明,在19個(gè)微衛(wèi)星座位中,DQ679223與殼寬性狀顯著相關(guān),EF056526與體重、殼長(zhǎng)、殼高、殼寬性狀顯著相關(guān),DQ221720與體重、殼高、殼寬性狀顯著相關(guān),FJ262409與體重顯著相關(guān)。因?yàn)橐恍┪稽c(diǎn)的某些基因型出現(xiàn)頻率太少,缺少比較分析的價(jià)值,因此每種基因型至少出現(xiàn)3次時(shí)才會(huì)統(tǒng)計(jì)其觀測(cè)值。在蝦夷扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記DQ679223座位上,AA基因型個(gè)體的殼寬均值顯著低于AB、BC基因型個(gè)體,且與AB基因型相差1.39mm,說明基因型AA對(duì)殼寬起負(fù)面影響作用。在微衛(wèi)星標(biāo)記EF056526座位上,AC基因型個(gè)體的體重、殼長(zhǎng)、殼高及殼寬的均值顯著高于AD基因型的個(gè)體,但與BC、BD基因型個(gè)體差異不顯著,說明基因型AC對(duì)生長(zhǎng)起到正面作用;AD基因型的殼寬值顯著低于其他基因型個(gè)體,說明AD基因型可能與殼寬負(fù)相關(guān)。在微衛(wèi)星標(biāo)記DQ221720座位中,BC基因型的個(gè)體的體重、殼高及殼寬的均值均小于其他基因型個(gè)體,其中殼高均值與AB基因型相差最大為10.48mm,說明BC基因型可能對(duì)生長(zhǎng)起負(fù)面作用;BB基因型個(gè)體各項(xiàng)的均值低于其他基因型個(gè)體,說明BB基因型與體重、殼長(zhǎng)、殼高等負(fù)相關(guān);AB基因型個(gè)體與AC基因型個(gè)體各項(xiàng)均值無顯著差異。微衛(wèi)星標(biāo)記FJ262409座位中:AB基因型個(gè)體體重的均值顯著高于CD基因型的個(gè)體,但與AD和BC基因型的個(gè)體差異不顯著,由此說明基因型AB在體重上起到正面的作用。3討論3.1適用的群體遺傳多樣性水平遺傳多樣性是評(píng)定物種資源狀況的重要依據(jù),最大限度地維持種內(nèi)的遺傳多樣性水平是持續(xù)利用種質(zhì)資源的前提。微衛(wèi)星DNA具有孟德爾遺傳特性及共顯性的特點(diǎn),因此可以根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)在不同群體中出現(xiàn)的等位基因頻率計(jì)算出雜合度、遺傳距離與遺傳分化等,從而進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和親緣關(guān)系鑒定。反映群體遺傳多樣性的度量值有Ne、Ho、He和PIC等,其數(shù)值越大表明群體遺傳結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,從而說明基因豐富度越高。本實(shí)驗(yàn)的材料取自一個(gè)家系群體,等位基因的數(shù)目最小為2,最大為4。本研究中,家系群體的Ne=3.02,Ho=0.2952,He=0.6352,PIC=0.5671,可以看出蝦夷扇貝的遺傳多樣性水平處于中等水平,低于張立冬等報(bào)道的大連大長(zhǎng)山蝦夷扇貝群體(Ne=2.47,Ho=0.48,He=0.67,PIC=0.639)的遺傳多樣性水平,但要高于陳蒙等報(bào)道的蝦夷扇貝群體的遺傳多樣性水平(Ne=2.40,Ho=0.6280,He=0.5240,PIC=0.4556)及張婧等分析的2個(gè)蝦夷扇貝家系的遺傳水平(Ne=2.8979,Ho=0.5299,He=0.6195,PIC=0.5663)。有效等位基因數(shù)(Ne)是反映群體遺傳多樣性大小的另一個(gè)指標(biāo)。本研究的19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)出60個(gè)等位基因,統(tǒng)計(jì)的有效等位基因數(shù)為57.33個(gè),數(shù)目接近實(shí)際等位基因數(shù),這表明本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)出的基因座位上的等位基因在群體中的分布是比較均勻的;卡方檢驗(yàn)Hardy-weinberg平衡P值表明16個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了不同程度的偏離(P<0.01),這說明群體內(nèi)的基因型頻率發(fā)生了變化。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的一個(gè)可能原因是研究的對(duì)象是家系群體,個(gè)體之間可能存在一定的親緣關(guān)系,從而導(dǎo)致位點(diǎn)偏離平衡;另一個(gè)原因可能是人工選育過程的過程比較復(fù)雜,每一代的外部環(huán)境及人工選擇壓力均會(huì)造成群體內(nèi)遺傳變異水平的波動(dòng),所以在對(duì)蝦夷扇貝進(jìn)行人工選育時(shí),可能導(dǎo)致一些基因丟失或發(fā)生突變,使其他等位基因和基因型的頻率增高,從而導(dǎo)致群體的基因型頻率發(fā)生變化。因此,在育苗時(shí)應(yīng)該保證種群數(shù)量的大小,避免近交的發(fā)生,以改善蝦夷扇貝的種質(zhì)資源。3.2系統(tǒng)發(fā)育特征結(jié)果蝦夷扇貝的體長(zhǎng)、殼重、殼高、殼寬等性狀屬于數(shù)量性狀,數(shù)量性狀受多個(gè)基因的控制,其遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜且容易受環(huán)境的影響。標(biāo)記和連鎖分析主要是檢測(cè)所標(biāo)記位點(diǎn)的基因型與數(shù)量性狀表型之間的差異,差異顯著則說明了標(biāo)記與數(shù)量性狀存在一定的關(guān)聯(lián)。因此如果一個(gè)群體的性狀差異非常顯著,或者2個(gè)群體間的差異很大,那么就可以通過分析標(biāo)記與性狀之間的相關(guān)性,找出性狀是否與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記遺傳上相關(guān),只要發(fā)現(xiàn)它們顯著相關(guān),就可以認(rèn)為存在這樣一個(gè)數(shù)量性狀的位點(diǎn),最后實(shí)現(xiàn)從表型到基因型選擇育種的轉(zhuǎn)變。本實(shí)驗(yàn)采用最小二乘分析法對(duì)蝦夷扇貝生長(zhǎng)性狀和微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星座位DQ679223、EF056526、DQ221720及FJ262409與蝦夷扇貝的生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。DQ679223座位上的基因型AA與殼寬呈負(fù)相關(guān),EF056526座位上的基因型AC與體重、殼長(zhǎng)、殼高、殼寬等顯著相關(guān),基因型AD對(duì)殼寬起負(fù)面作用,DQ221720座位上的基因型BC在體重、殼高、殼寬等方面起到負(fù)面作用,FJ262409座位上的基因型AB在體重上起正面作用。因此,認(rèn)為與蝦夷扇貝生長(zhǎng)相關(guān)的基因可能位于這幾個(gè)位點(diǎn)附近,通過進(jìn)一步分析這些位點(diǎn)附近的基因序列能夠獲得與蝦夷扇貝生長(zhǎng)的功能基因,這對(duì)未來蝦夷扇貝的分子輔助育種具有極大的指導(dǎo)意義。4遺傳育種方面的研究物種的群體遺傳多樣性保證了物種的進(jìn)化和