參苓白術(shù)散對(duì)小鼠炎癥性腸病的保護(hù)作用及其機(jī)制

參苓白術(shù)散對(duì)小鼠炎癥性腸病的保護(hù)作用及其機(jī)制

炎癥疾?。╥bd）包括潰瘍性胃炎（iu）和克羅恩病（cd）。這是由遺傳因素、環(huán)境因素和免疫因素引起的腸內(nèi)炎癥疾病。研究發(fā)現(xiàn)IBD時(shí)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞活性氧簇(ROS)的大量產(chǎn)生,氧化應(yīng)激引起的炎癥受到修飾,這可能與UC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。IBD在中醫(yī)學(xué)中并沒(méi)有與之完全對(duì)應(yīng)的病名,根據(jù)其臨床特點(diǎn),可歸屬于“痢疾”、“泄瀉”、“腸癖”、“下痢”等范疇。本病的發(fā)生多由于脾氣受損,濕從內(nèi)生,濕滯日久,多從熱化,濕熱薰蒸,塞滯腸間,傳導(dǎo)失司,與氣血相搏結(jié),損傷血絡(luò),氣凝血滯,血敗肉腐,內(nèi)潰成瘍,日久漸波及于腎、脾腎兩虛。參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》,其原方功效為益氣健脾,滲濕止瀉。臨床研究證實(shí)參苓白術(shù)散加減方可以用于IBD的治療,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明參苓白術(shù)散加減方可以有效地增加結(jié)腸炎小鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的表達(dá),同時(shí)具有一定的保護(hù)腸上皮免疫屏障的作用。但是,參苓白術(shù)散對(duì)IBD的治療作用以及具體機(jī)制需要進(jìn)一步的探討。本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)入手,觀察參苓白術(shù)散對(duì)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠的IBD的影響,初步探討其可能機(jī)制。1材料表面1.1調(diào)節(jié)性抗體ros葡聚糖硫酸鈉(MW5000,Fluka公司,9011-18-1);5-氨基水楊酸(5-ASA,Sigma公司,89-57-6);參苓白術(shù)散(云南白藥集團(tuán)股份有限公司,Z20044106);髓過(guò)氧化物酶(MPO)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);活性氧(ROS)初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司);鼠抗β-Tubulin單克隆抗體(Sigma公司,T6074);鼠抗IL-1β單克隆抗體(Bio-Legend公司,JAMA-147);鼠抗IL-6單克隆抗體(Bio-Legend公司,D7715A7);兔抗TNF-α多克隆抗體(博士德公司,BA0131);HRP-鼠IgG(Sigma公司,170-6516);HRP-兔IgG(武漢博士德公司,BA1020)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物BALB/c小鼠,SPF級(jí),動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(贛)2010-0002,雄性,6~8周齡,體重(20±2)g,購(gòu)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部,飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房。1.3dna成像系統(tǒng)儀器GelDoc2000分子成像儀(BIO-RAD公司),電泳電源(BIO-RAD公司),DNA瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad公司),垂直電泳儀,轉(zhuǎn)膜儀(BioRad公司),DNA分子成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司),高速冷凍離心機(jī)(Beckman公司),臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf公司)。2方法2.1試劑的制備DSS制備成5%的溶液;5-ASA配制成10g·L-1的溶液;NAC配制成1.33g·L-1的溶液。2.2參茯苓白術(shù)散組織正常組:按照正常飲食飲水;IBD模型組:以5%DSS自由飲用成模;低、中、高劑量參苓白術(shù)散組:IBD成模的小鼠分別再給予3,6,12g·kg-1參苓白術(shù)散ig15d;5-ASA組:IBD成模的小鼠再給予美沙拉嗪2g·kg-1ig15d。2.3糞樣的觀察5%DSS溶液自由飲用7d造成急性潰瘍性結(jié)腸炎模型,同時(shí)予以生理鹽水、5-氨基水楊酸、參苓白術(shù)散高、中、低劑量ig,每日觀察進(jìn)食、飲水、活動(dòng)等一般情況,稱(chēng)量體重,觀察糞便性狀及糞便隱血情況。15d后,處死小鼠,取出肛門(mén)至盲腸末端的整個(gè)結(jié)腸和直腸段,部分在-80℃冰箱保存用于生化以及Westernblot分析,部分組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片,HE染色,觀察病理改變。2.4通過(guò)測(cè)定腸道組織的骨髓氧化物pmo將結(jié)腸組織制備成10%的組織勻漿,參照試劑盒方法測(cè)定結(jié)腸組織勻漿中MPO含量。2.6vict3moltilmaet預(yù)測(cè)檢測(cè)血管蛋白表達(dá)根據(jù)ROS初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū),將組織稱(chēng)重,清洗,加入稀釋液,勻漿,定量,最后將各血管蛋白調(diào)至一致濃度,各取50μL,加入染色液后于VICTOR3MultilablePlateCounter檢測(cè):激發(fā)波長(zhǎng)485nm,散發(fā)波長(zhǎng)535nm。RFU=(樣品RFU-對(duì)照RFU)。2.7離心菌株-轉(zhuǎn)糖凝膠電泳(1)蛋白提取:取出-80℃冰箱的血管組織,放入研缽中,液氮研碎;加Western及IP細(xì)胞裂解液及PMSF配制液,繼續(xù)研磨,至組織樣品完全裂解30min后,即可將裂解液移至1.5mL離心管中置于離心機(jī)中10000~14000×g離心3~5min,取上清,分裝保存于-80℃冰箱。(2)電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育,顯影:蛋白定量后,采用十二烷基硫酸鈉-變性聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)緩沖系統(tǒng),進(jìn)行電泳。然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,將PVDF膜放入抗TNF-α,IL-1β與IL-6等一抗(1∶400)中孵育,4℃過(guò)夜,清洗,加入二抗常溫下孵育1h,清洗,顯影。2.9病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)由有經(jīng)驗(yàn)病理醫(yī)生對(duì)結(jié)腸組織學(xué)損傷進(jìn)行評(píng)分,每個(gè)切片隨機(jī)選取15個(gè)高倍視野(400倍)計(jì)分,取其平均值。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:炎癥:無(wú)為0分;輕度1分;重度2分。病變無(wú)0分;黏膜下層1分;肌層2分;漿膜層3分。隱窩破壞無(wú)為0分;基底1/3破壞1分;基底2/3破壞2分;僅有完整表皮3分;全部隱窩和上皮破壞4分。病變范圍1%~25%,1分;26%~50%,2分;51%~75%,3分;76%~100%,4分。2.10統(tǒng)計(jì)方法計(jì)量資料采用表示,統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.5軟件,計(jì)量資料組間比較用t檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計(jì)意義。3結(jié)果3.1小鼠小鼠dai積分DAI積分是從小鼠的癥狀、體征及大便情況反映潰瘍性結(jié)腸炎病情嚴(yán)重程度的一種積分形式,它是由糞便隱血便血、糞便性狀及體重變化3個(gè)指標(biāo)組成。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠的DAI積分無(wú)顯著性差異,飲用DSS后除正常組外各組小鼠DAI積分隨時(shí)間而開(kāi)始逐漸升高,反映結(jié)腸炎的病情在逐漸加重。而模型組的DAI積分較5-ASA組、不同劑量的參苓白術(shù)散高,差異具有顯著性(P<0.05),各組與正常組比較均具有顯著性差異(P<0.05),見(jiàn)表2。3.2結(jié)腸組織病理學(xué)檢測(cè)正常組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),與各組積分有顯著性差異(P<0.01)。模型組、鹽水組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞廣泛缺失,腺體大多數(shù)不完整,炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn),呈典型炎癥改變;5-ASA組、參苓白術(shù)散組結(jié)腸黏膜腺體基本完整,局部有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或隱窩破壞,與模型組、鹽水組比較有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表2以及圖1。3.4參茯苓白術(shù)散對(duì)tnf-、il-6表達(dá)的影響與正常組比較,模型組的TNF-α,IL-1β以及IL-6的表達(dá)明顯升高,而不同質(zhì)量濃度的參苓白術(shù)散可以顯著地降低TNF-α,IL-1β以及IL-6的表達(dá)水平,見(jiàn)圖2。4參茯苓白術(shù)散對(duì)ud病理變化的作用IBD發(fā)病時(shí),腸黏膜中大量的吞噬細(xì)胞從血液循環(huán)入腸黏膜層和黏膜下層,當(dāng)它們?cè)谕淌僧愇锘虮患せ詈?增加耗氧量導(dǎo)致黏膜細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,同時(shí)生成非自由基的過(guò)氧化氫,后者能與超氧陰離子自由基相互反應(yīng),生成具有更高活性的羥自由基(OH·),對(duì)腸黏膜的危害非常大。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,其含量反映了組織中過(guò)氧化損傷程度,它本身能使腸黏膜組織損害進(jìn)一步加重。MPO存在于中性粒細(xì)胞中,是反應(yīng)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)目多少,該指標(biāo)較靈敏地反映組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散能夠明顯地減少I(mǎi)BD模型的腸組織中ROS,MDA,MPO的含量,提示它對(duì)DSS誘導(dǎo)的氧化損傷以及炎癥損傷有一定的保護(hù)作用。IL-1是IBD發(fā)病中一個(gè)重要的細(xì)胞因子。IL-1與受體結(jié)合后,通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)激活包括IL-6在內(nèi)的多種細(xì)胞因子。研究顯示IBD患者黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞IL-1β,IL-6水平的表達(dá)升高,且表達(dá)水平與黏膜的炎癥和壞死、疾病嚴(yán)重程度、累及范圍以及是否復(fù)發(fā)有關(guān)密切相關(guān);TNF-α是IBD發(fā)病中很重要的損傷性細(xì)胞因子之一,炎癥腸段的炎性細(xì)胞所分泌的TNF-α能進(jìn)一步損傷結(jié)腸組織,放大腸道炎癥反應(yīng),抑制TNF-α的合成、分泌能有效地抑制腸道局部炎癥反應(yīng),TNF-α是UC炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心分子。中醫(yī)中雖無(wú)IBD此病名,但有類(lèi)似病變和臨床表現(xiàn)的論述,本病應(yīng)屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“泄瀉”、“痢疾”、“便血”、“腸僻”“大瘕泄”等病證范疇。脾虛是發(fā)病之根本,多種致病因素導(dǎo)致脾失健運(yùn),濕熱蘊(yùn)結(jié)腸腑,大腸傳導(dǎo)失司,腸絡(luò)受損,血敗肉腐,最終內(nèi)潰成瘍。研究顯示,中醫(yī)“脾”的概念與機(jī)體免疫功能密切相關(guān),脾虛通過(guò)影響?zhàn)つは嚓P(guān)的IgA、SIgA分泌,下調(diào)免疫應(yīng)答的效應(yīng)T細(xì)胞,破壞黏膜免疫系統(tǒng),TNF-α,IL-1,IL-6等促炎因子的增多,IL-10抑炎因子的減少。參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》,其原方功效為益氣健脾,滲濕止瀉。方中人參、白術(shù)、茯苓益氣健脾滲濕為君,配伍山藥、蓮子肉助君藥以健脾益氣,兼能止瀉;并用白扁豆、薏苡仁助白術(shù)、茯苓以健脾滲濕,均為臣藥。更用砂仁醒牌和胃,行氣化滯,是為佐藥。桔梗宣肺利氣,通調(diào)水道,又能載藥上行,培土生金;炒甘草健脾和中,調(diào)和諸藥,共為佐使。綜觀全方,補(bǔ)中氣,滲濕濁,行氣滯,使脾氣健運(yùn),濕邪得去,則諸癥自除。臨床研究證實(shí)參苓白術(shù)散加減方可以用于IBD的治療,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明參苓白術(shù)散加減方可以有效地增加結(jié)腸炎小鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的表達(dá),同時(shí)具有一定的保護(hù)腸上皮免疫屏障的作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),參苓白術(shù)散能改善DSS引起的小鼠體重下降、隱血、便血等癥狀,降低DAI積分及組織病理?yè)p傷評(píng)分等,同時(shí)使得ROS,MDA,MPO含量較模型組顯著下降,表明參苓白術(shù)散能緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀,減輕黏膜組織損傷和炎癥損傷程度;研究還發(fā)現(xiàn)正常組小鼠結(jié)腸組織基本不表達(dá)IL-1β,IL-6,TNF-α,而模型組小鼠結(jié)腸組織的IL-1β,IL-6,TNF-α的蛋白質(zhì)表達(dá)均開(kāi)始上調(diào),其表達(dá)的多少同樣也與DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的癥狀呈正相關(guān),而不同劑量的參苓白術(shù)散有抑制IBD結(jié)腸組織的IL-1β,IL-6,TNF-α的蛋白質(zhì)上調(diào)的作用,說(shuō)明參苓白術(shù)散抗IBD與抗氧化應(yīng)激以及