白介素-10基因敲除小鼠炎性腸病模型腸屏障的修復(fù)

白介素-10基因敲除小鼠炎性腸病模型腸屏障的修復(fù)

雖然未清楚xygram的病因，但xybflimate（ibd）的病因尚未得到清楚的評估，但人們普遍認(rèn)為，腸道菌群中各種抗生素對遺傳易感細(xì)胞的持續(xù)刺激是導(dǎo)致腸道疾病的重要因素。已有研究表明,腸道菌群是IBD發(fā)生、發(fā)展的先決條件,而益生菌具有較強(qiáng)的菌群調(diào)節(jié)能力。近年來的研究亦表明,益生菌能夠有效緩解IBD患者的臨床表現(xiàn),具有積極的治療作用。盡管如此,目前尚缺乏有關(guān)益生菌對IBD作用機(jī)理的深入研究。為此,本實(shí)驗(yàn)以國際上普遍采用的白介素10基因敲除(IL-10-/-)小鼠為IBD模型,開展植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,LP)對腸屏障功能的修復(fù)機(jī)理研究。1材料和方法1.1il-10-/-小鼠及野生型wt小鼠的培養(yǎng)和培養(yǎng)LP由上海交大昂立醫(yī)藥研究院提供,以低壓凍干菌粉的形式在-20℃以下保存,菌粉用Ringer緩沖液稀釋后2h內(nèi)經(jīng)改良MC培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48h,其活菌數(shù)達(dá)5×1010CFU/g。129品系IL-10-/-小鼠及野生型(WT)小鼠均購自美國JacksonLaboratories公司。本實(shí)驗(yàn)所使用的小鼠均為8周齡雌性小鼠,并以IL-10-/-小鼠作為IBD模型。1.2材料和實(shí)驗(yàn)方法ZO-1抗體(SantaCruz,CA,USA),occludin、β-catenin、claudin-1抗體(SanFrancisco,CA,USA)。IRDye-800或IRDye-700標(biāo)記的二抗,LI-CORBioscience,Lincoln,NE。Ringer緩沖液、改良MC培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基,上海市疾控中心。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)檢測試劑盒,BDPharmingen,Oxford,UK;厭氧罐和厭氧產(chǎn)氣袋,生物梅里埃公司;MicroscanAutoscan-4細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和RA-ID板,DadeBehring公司;SW-CJ超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司;DNP-9028恒溫培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TMQ.R-3250壓力蒸汽滅菌器,山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;HHS型恒溫水浴鍋,上海博訊有限公司;VM-10漩渦振蕩器,上海精科實(shí)業(yè)有限公司;Ultra-Turrax勻漿儀,IRK-WERKE,Germany;透射電鏡,Philip,Eindhoven,Netherlands;UssingChamber,EasyMountChamber,PhysiologicInstruments,SanDiego,CA,USA;OdysseyInfrare圖像分析系統(tǒng),LI-CORBioscience,Lincoln,NE。1.3方法1.3.133cfp懸液的配制LP菌株于MRS液體培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)12h,5000r/min(r=6cm)離心5min后除去上清液,菌體重懸于無菌Ringer緩沖液中,利用分光光度法配制成2.0×109CFU/ml濃度的LP懸液。1.3.2益生菌干預(yù)組1.將8周齡雌性小鼠采用簡單隨機(jī)法(隨機(jī)表)分成WT組、WT+LP組、IL-10-/-組和IL-10-/-+LP組,每組10只。益生菌干預(yù)組每日灌胃0.5mlLP液(1.0×109CFU),其余灌胃Ringer緩沖液0.5ml,持續(xù)4周。于實(shí)驗(yàn)開始后第0、2、4周收集小鼠糞便樣本,檢測腸道菌群變化,于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集結(jié)腸組織行組織學(xué)、通透性和電生理及緊密連接蛋白表達(dá)研究,并對各組小鼠腹瀉、直腸脫垂和體重變化情況予以監(jiān)測。1.3.3炎癥評估結(jié)腸組織用10%甲醛固定,經(jīng)常規(guī)處理、6μm切片、HE染色后鏡檢,觀察其組織結(jié)構(gòu)并給予炎癥評分。1.3.4turrax勻漿條件的確定將切取的結(jié)腸組織置于800μl含有PBS、2%FCS和0.5%溴化十六烷基三甲胺的冷勻漿液中,用Ultra-Turrax勻漿儀勻漿后在4℃離心15min(17940×g)。按照ELISA試劑盒說明檢測上清液中TNF-α和IFN-γ濃度,以pg/mg組織表示。1.3.5阿利克氏體的制備將小鼠新鮮結(jié)腸組織經(jīng)PBS沖洗后用組織包埋劑包埋(Sakura,USA),并置于-80℃保存。將冰凍組織10μm切片后在95℃10mmol/L枸櫞酸鈉溶液中孵育5min,冷卻至室溫。用含有5%牛血清白蛋白和5%胎牛血清的PBS室溫下孵育30min以消除非特異性背景。將以上切片與緊密連接蛋白ZO-1、claudin-1、occludin和β-catenin一抗在4℃下孵育過夜,再用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽室溫下染色1h。再經(jīng)相應(yīng)熒光素標(biāo)記的二抗孵育后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白定位。1.3.6脫氧膽酸鹽類將結(jié)腸組織超聲粉碎后置于冷的裂解液中[1μl/ml緩沖液,50mmol/LTris-HCl,pH7.4,150mmol/LNaCl,1%NP-40(IgepalCA-630),0.5%脫氧膽酸鹽,0.1%十二烷硫酸鈉和5mmol/LEDTA],裂解60min。按照Zeissig等方法將提取蛋白分離、一抗(ZO-1、claudin-1、occludin、β-catenin),用IRDye-800或IRDye-700標(biāo)記的二抗孵育,以β-tubulin作為內(nèi)參,OdysseyInfrare圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量分析,結(jié)果以相對豐度表示。1.3.7添加甘露醇根據(jù)Madsen等的方法,檢測腸上皮細(xì)胞跨膜電阻(TER)和細(xì)胞旁路甘露醇通透性,以此反映腸上皮的屏障功能。將新鮮剝離的結(jié)腸黏膜組織固定于UssingChamber,兩側(cè)室灌注3ml37℃氧合Krebs緩沖液。調(diào)節(jié)電壓鉗零電壓,以1mV刺激電壓每隔60s刺激0.5s,記錄跨膜電流(ΔIsc)和電壓(PD),TER=PD/ΔIsc。為檢測腸上皮細(xì)胞旁路甘露醇通透性,將3%甘露醇添加到黏膜面?zhèn)热芤褐?平衡30min后,每隔30min抽取漿膜面溶液200μl,持續(xù)2h,并置于液氮中保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后利用HPLC檢測甘露醇濃度。1.3.8皮細(xì)胞間聯(lián)合組織觀察結(jié)腸標(biāo)本沖洗后切成10mm×5mm大小,2%戊二醛固定,4℃孵育2h,經(jīng)系列脫水后環(huán)氧樹脂包埋,超微切片(80nm),透射電鏡觀察上皮細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)變化。1.4組患者ssa采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用單因素方差分析(One-WayANOVA),組間比較采用SNK法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1cp有助于減少腸道炎癥2.1.1中性細(xì)胞和細(xì)胞浸漬組織學(xué)分析顯示,IL-10-/-組小鼠均有結(jié)腸炎癥表現(xiàn),表現(xiàn)為黏膜潰瘍、糜爛和大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤;而益生菌干預(yù)后,IL-10-/-+LP組小鼠僅表現(xiàn)為輕度中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤,WT組和WT+LP組小鼠無以上炎癥表現(xiàn),見圖1。2.1.2兩組小鼠腹瀉和腸推薦干預(yù)的比較,見表1IL-10-/-組小鼠腹瀉和直腸脫垂發(fā)生率顯著高于WT組[70%(7/10)比0(0/10),P<0.01;20%(2/10)比0(0/10),P<0.01];LP干預(yù)后,IL-10-/-+LP組小鼠較IL-10-/-組腹瀉和直腸脫垂發(fā)生率明顯降低[30%(3/10)比70%(7/10),P<0.01;0(0/10)比20%(2/10),P<0.01]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,IL-10-/-+LP組小鼠較IL-10-/-組小鼠體重出現(xiàn)明顯的增加[(22.1±1.8)g比(20.3±1.7)g,P<0.01]。2.1.3周lp治療前后il-10-/-+lp組與il-10-/-+lp組治療前后炎癥評分比較IL-10-/-組炎癥評分明顯高于WT組(P<0.01);而經(jīng)4周LP治療后,IL-10-/-+LP組較IL-10-/-組炎癥評分出現(xiàn)了明顯降低(P<0.01),但并未恢復(fù)至正常水平;WT組與WT+LP組的炎癥評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2。2.1.4wt組與wt組比較IL-10-/-組小鼠促炎細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ濃度較WT組顯著增高(P<0.01);LP干預(yù)后,IL-10-/-+LP組小鼠較IL-10-/-組TNF-α和IFN-γ濃度明顯降低(P<0.01),見圖3A和圖3B。2.2lc促進(jìn)了緊密連接緊密蛋白的出現(xiàn)2.2.1enin分布WT組和WT+LP組緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和β-catenin主要分布在腸上皮細(xì)胞頂膜,呈連續(xù)性分布;而IL-10-/-組小鼠則表現(xiàn)出緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和β-catenin在細(xì)胞頂膜的熒光強(qiáng)度減弱和不連續(xù)性分布,且ZO-1、occludin和β-catenin存在細(xì)胞內(nèi)異常分布,見圖4。2.2.2claudin、claudin-1、claudin-1及claudin-1的表達(dá)定性檢測結(jié)果見圖5。定量檢測結(jié)果(圖6A～6D)顯示,IL-10-/-組小鼠腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1表達(dá)較WT組均出現(xiàn)下降(P<0.01),而β-catenin表達(dá)雖然降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而經(jīng)4周LP干預(yù)治療后,IL-10-/-+LP組較IL-10-/-組緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1表達(dá)均顯著增強(qiáng)(P<0.01)。2.3lc降低了細(xì)胞的側(cè)路滲透性，防止腸上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)破壞2.3.1ter0.763.4IL-10-/-組小鼠腸上皮細(xì)胞旁路對甘露醇的累積通透性明顯高于WT組[(2.17±0.37)%比(0.76±0.14)%,P<0.001;見圖7A],且TER出現(xiàn)了明顯降低[(38.31±12.70)Ω/cm2比(73.34±3.91)Ω/cm2,P<0.001;見圖7B];而LP干預(yù)后,IL-10-/-+LP組較IL-10-/-組的甘露醇累積通透性顯著降低2.3.2小鼠腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化透射電鏡分析表明,WT組和WT+LP組小鼠腸上皮結(jié)構(gòu)完整,而IL-10-/-組小鼠腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化明顯,表現(xiàn)為緊密連接結(jié)構(gòu)、微絨毛的破壞、細(xì)胞間縫隙增寬、細(xì)胞空泡化及染色體沉積,甚至上皮細(xì)胞的凋亡;LP治療4周后能明顯減輕以上IL-10-/-組小鼠腸上皮細(xì)胞的破壞(圖8A～8D)。3益生菌改善腸道屏障功能相關(guān)因素近年來,隨著人民生活水平的提高,IBD在我國的發(fā)病率逐年增高,而IBD病因至今未明,且無法治愈,嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量。目前認(rèn)為,IBD是遺傳、環(huán)境、免疫等因素綜合作用的結(jié)果,而腸上皮屏障功能障礙在IBD發(fā)病機(jī)理中起到了至關(guān)重要的作用。臨床研究證實(shí),克羅恩病(CD)患者存在腸上皮屏障功能障礙,表現(xiàn)為通透性增加,且其10%～20%一級健康親屬亦存在腸上皮通透性增加;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),腸上皮通透性增加與上皮細(xì)胞間連接蛋白的低表達(dá)和(或)分布異常有關(guān)。此外,CD患者亦常發(fā)生腸道菌群失調(diào)和細(xì)菌移位。以上提示,來自異常腸道菌群的大量抗原能透過受損的腸上皮細(xì)胞屏障持續(xù)刺激腸黏膜下免疫細(xì)胞,引起腸上皮損傷,導(dǎo)致腸炎的發(fā)生、發(fā)展。而研究證實(shí),益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群和增強(qiáng)腸道屏障功能的作用,但其具體作用機(jī)制尚不明確。體外實(shí)驗(yàn)研究顯示,益生菌能有效阻止致病性大腸桿菌(EPEC)引起的腸上皮細(xì)胞Caco-2細(xì)胞旁路通透性的增加和TER的降低,從而修復(fù)了受損的腸上皮細(xì)胞屏障。有研究發(fā)現(xiàn),益生菌的這種作用與其阻止EPEC誘導(dǎo)的緊密連接蛋白異常分布和磷酸化水平降低有關(guān)。我們先前研究亦證實(shí),LP能通過增強(qiáng)緊密連接蛋白(ZO-1、claudin-1、occludin、JAMA-1)在細(xì)胞頂膜的表達(dá)來阻止EPEC對Caco-2細(xì)胞屏障功能的破壞作用。以上研究均提示益生菌對腸道上皮屏障功能的修復(fù)作用可能與其促進(jìn)細(xì)胞間緊密連接蛋白