蛋氨酸與半胱氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物分析

蛋氨酸與半胱氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物分析

幾千年來，金華火腿是中國人民加工肉品的經(jīng)驗(yàn)和智慧結(jié)晶。它以其色澤、香氣、口感和形狀聞名于世界各地，深受人們喜愛。風(fēng)味是金華火腿重要的品質(zhì)特征,對其獨(dú)特風(fēng)味的研究是歷年來的研究熱點(diǎn)。金華火腿獨(dú)特的風(fēng)味成分主要形成于成熟時(shí)期。游離氨基酸(FAA)參與的美拉德反應(yīng)、Strecker降解反應(yīng)對火腿風(fēng)味的形成具有重要作用。蛋氨酸和半胱氨酸是金華火腿成熟中期主要的含硫氨基酸。有文獻(xiàn)報(bào)道,含硫氨基酸和還原糖之間的美拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生似肉的芳香。金華火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的含硫化合物主要是由含硫氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸經(jīng)過一系列反應(yīng)生成,這些含硫化合物的閾值很低,對火腿風(fēng)味影響較大。以上研究結(jié)果只是根據(jù)金華火腿中檢測出的揮發(fā)性含硫化合物推測得出的,但是對于含硫氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的具體研究,以及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在金華火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成中的作用,目前還未見詳細(xì)報(bào)道。由于在復(fù)雜的火腿體系中研究風(fēng)味成分的來源困難較大,而且一些有關(guān)氨基酸與還原糖美拉德反應(yīng)的研究多是在高溫環(huán)境條件下進(jìn)行的,與金華火腿成熟環(huán)境差異較大,不能準(zhǔn)確地闡明美拉德反應(yīng)對火腿風(fēng)味物質(zhì)的貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過模擬金華火腿成熟環(huán)境,采用固相微萃取(SPME)和氣相-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)等一系列技術(shù)對金華火腿中主要含硫氨基酸(蛋氨酸、半胱氨酸)美拉德反應(yīng)揮發(fā)性產(chǎn)物進(jìn)行分析,鑒定出火腿中蛋氨酸、半胱氨酸美拉德反應(yīng)的揮發(fā)性產(chǎn)物,并研究這些揮發(fā)性產(chǎn)物對火腿風(fēng)味的貢獻(xiàn),以期為火腿風(fēng)味物質(zhì)形成過程的研究提供一定的基礎(chǔ),更好地指導(dǎo)金華火腿風(fēng)味的研究。1材料和方法1.1spme萃取裝置蛋氨酸、半胱氨酸、葡萄糖(均為色譜純)美國ChemService公司。固相微萃取裝置(75?mCAR/PDMS萃取頭、SPME專用15mL頂空萃取瓶)、GC-MS裝置美國Finnigan公司;DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。1.2中期蛋氨酸、半胱氨酸、葡萄糖的含量以5g金華火腿為樣品,根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)檢測出的金華火腿成熟中期游離氨基酸的含量,確定5g金華火腿成熟中期蛋氨酸、半胱氨酸、葡萄糖的含量分別為1.208×10-2、1.025×10-3、2.500×10-3g,并根據(jù)含量分別配制20mmol/L蛋氨酸、半胱氨酸和葡萄糖溶液,在頂空萃取瓶中確定2個(gè)獨(dú)立反應(yīng):蛋氨酸+葡萄糖、半胱氨酸+葡萄糖,置于40℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)15d后于―40℃冰箱中保存。1.2.1老化2h將固相微萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口240℃老化2h。萃取頭插入樣品瓶并推出吸附纖維頭,40℃恒溫吸附35min,隨后插入氣相色譜儀進(jìn)樣口240℃解吸5min。1.2.2載氣he流速2.2min,ktbk、20kpa恒壓kfm、模式1.2參考Gaspardo等的方法并略作改動。色譜條件:DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(30mm×0.25mm,0.25?m),載氣He流速0.3mL/min、不分流、35kPa恒壓,進(jìn)樣口和接口溫度240℃。升溫程序:起始柱溫40℃保持2min,5℃/min升至60℃,10℃/min升至100℃,18℃/min升至240℃保留6min,FID檢測溫度240℃。質(zhì)譜條件:離子源溫度200℃、電離方式EI、電子能量70eV,燈絲電流150?A,掃描質(zhì)量范圍m/z33~450。1.2.3-n-可培養(yǎng)成分檢測GC-MS分析圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)和人工方式把檢出的每個(gè)峰同時(shí)與Meanlib、Replib、Willey、Nistdemo4個(gè)圖譜庫進(jìn)行比較,相似指數(shù)(SI)在800以上者為確定的化合物?；衔锒繛榘捶迕娣e歸一化法計(jì)算相對含量。2揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)圖1為金華火腿成熟中期條件下蛋氨酸美拉德反應(yīng)揮發(fā)性產(chǎn)物的GC-MS圖譜。圖2為金華火腿成熟中期條件下半胱氨酸美拉德反應(yīng)揮發(fā)性產(chǎn)物的GC-MS圖譜。由表1可知,蛋氨酸反應(yīng)體系共檢出23種揮發(fā)性產(chǎn)物,主要包括含硫化合物、醇、醛、酮、酸;由表2可知,半胱氨酸反應(yīng)體系共檢出18種揮發(fā)性產(chǎn)物,主要包括醛、酮、含氮化合物、含硫化合物。其中3-環(huán)丙基-1-丁炔、壬醛、乙酸、4-苯甲?；?2-氫-吡喃-3-酮、2-乙基-1-己醇、2-羥基-2-(對甲氧苯基)-3-羥基羰基-3-甲基-丁烷、[2,3-c]喹啉-6(5H)-酮-2-甲氧基苯并噻吩是蛋氨酸、半胱氨酸揮發(fā)性產(chǎn)物中的相同物質(zhì)。在蛋氨酸的23種揮發(fā)性產(chǎn)物中,共有10種產(chǎn)物屬于金華火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),這10種物質(zhì)分別是:甲硫醇、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物、三甲基硫代丙醛、乙酸、2-乙基-1-己醇、辛醛、壬醛、苯甲醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮;半胱氨酸的18種揮發(fā)性產(chǎn)物中,共有7種產(chǎn)物屬于金華火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。這7種物質(zhì)分別是:乙酸、2-乙基-1-己醇、己醛、壬醛、丙酮、3-羥基-2-丁酮、苯乙酮。由于含硫氨基酸與葡萄糖的美拉德反應(yīng)是在模擬金華火腿高溫成熟的環(huán)境條件下進(jìn)行的,由GC-MS分析結(jié)果可知,高溫的環(huán)境加劇了火腿中美拉德反應(yīng),生成多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。其中甲硫醇、乙酸、3-羥基-2-丁酮、2-乙基-1-己醇、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物、己醛是金華火腿重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),這說明金華火腿高溫成熟環(huán)境條件下的美拉德反應(yīng)對火腿風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要作用。3討論3.1分離的風(fēng)味物質(zhì)從結(jié)果可以看出,蛋氨酸是火腿中含硫化合物的主要提供者,甲硫醇、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物是蛋氨酸美拉德反應(yīng)的特征產(chǎn)物,而且二甲基二硫化物的相對含量高達(dá)52.51%。含硫化合物由于其較低的風(fēng)味閾值而成為肉品風(fēng)味的重要因素,二甲基二硫化物和二甲基三硫化物更被認(rèn)為是金華火腿的主體風(fēng)味成分。Flores等也曾提出,干腌火腿中的含硫化合物主要是通過含硫氨基酸降解產(chǎn)生,如蛋氨酸降解可產(chǎn)生甲硫醇,甲硫醇氧化可生成二甲基二硫化物,進(jìn)一步反應(yīng)可生成二甲基三硫化物和二甲基硫化物,三甲基硫代丙醛可能來自于美拉德反應(yīng)的分支氨基酸Strecker降解,二甲基二硫化物來自三甲基硫代丙醛的分解。通過蛋氨酸和半胱氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物分析可以看出,金華火腿中含硫揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要由蛋氨酸提供。這可能是因?yàn)榻鹑A火腿成熟中期的半胱氨酸含量非常低,僅為蛋氨酸10%的緣故。3.2支鏈氨基酸streger降解半胱氨酸類化合物蛋氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的醇類物質(zhì)為三甲基硫代丙醇、4-甲基-3-戊烯-1-醇、4-乙炔基-4-甲基-1,5-己二烯-3-醇、2-乙基-1-己醇,其中2-乙基-1-己醇在半胱氨酸的產(chǎn)物中也有檢測到。支鏈氨基酸Strecker降解可以產(chǎn)生支鏈羰基化合物和醇,如三甲基硫代丙醇、2-乙基-1-己醇。雖然醇類物質(zhì)的含量很高,但由于醇的風(fēng)味閾值與其他羰基化合物相比較高,所以其風(fēng)味在肉品中被認(rèn)為是不重要的,但其可以作為風(fēng)味前體物質(zhì)參與后期的反應(yīng)。3.3ecker反應(yīng)蛋氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的醛類物質(zhì)為辛醛、壬醛和苯甲醛;半胱氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物醛類物質(zhì)為己醛和壬醛。醛類物質(zhì)主要是由氨基酸的Strecker降解反應(yīng)產(chǎn)生。醛類物質(zhì)由于閾值很低,對火腿風(fēng)味具有較大的貢獻(xiàn)。己醛、辛醛和壬醛不僅是金華火腿重要的風(fēng)味物質(zhì),還可以增加Serrano火腿的清香氣味,與Iberian火腿的風(fēng)味也密切相關(guān)。苯甲醛在Corsican火腿中也有發(fā)現(xiàn)。章建浩等研究發(fā)現(xiàn)在金華火腿成熟過程中醛類物質(zhì)的總體相對比例逐漸降低,表明醛也是火腿成熟過程的中間產(chǎn)物,同時(shí)可能轉(zhuǎn)變?yōu)轸人岬绕渌麚]發(fā)性成分。3.4糖原內(nèi)化信息中的化合物從結(jié)果可以看出,半胱氨酸美拉德反應(yīng)主要產(chǎn)物為酮類物質(zhì),這可能來自于氨基酸或者是糖類物質(zhì)的降解,如丙酮、3-羥基-2-丁酮可能來自糖原的降解,3-羥基-2-丁酮也可以轉(zhuǎn)化為2,3-丁二酮。丙酮在酮類物質(zhì)中所占比重較大,這與火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中丙酮在酮類物質(zhì)中所占比重較一致。蛋氨酸反應(yīng)產(chǎn)物中的6-甲基-5-庚烯-2-酮已在金華火腿中直接檢測到。3.5氨基酸美拉德反應(yīng)2-乙基己酸和乙酸分別是蛋氨酸和半胱氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物,在火腿中羧酸類物質(zhì)可能來自氨基酸美拉德反應(yīng)中的脫氨反應(yīng),也可能是醛類和酮類等物質(zhì)轉(zhuǎn)變而來。劉登勇等認(rèn)為由于乙酸的風(fēng)味閾值太高,故其對火腿整體的風(fēng)味貢獻(xiàn)非常小。但章建浩等認(rèn)為金華火腿高溫成熟環(huán)境使羧酸顯著增加,也是金華火腿具有獨(dú)特風(fēng)味的原因。3.6美拉德反應(yīng)中雜環(huán)化合物的生成蛋氨酸和半胱氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物中有大量的雜環(huán)類物質(zhì),這可能是由于美拉德反應(yīng)過程復(fù)雜,反應(yīng)過程中產(chǎn)生許多中間產(chǎn)物。曾有學(xué)者提出,美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物中含有大量的雜環(huán)化合物,包括呋喃、吡咯、噻吩、吡啶、噻唑等,[2,3-c]喹啉-6(5H)-酮-2-甲氧基苯并噻吩、2-甲基四氫噻吩-3-酮、4-苯甲酰基-2-氫-吡喃-3-酮、N-乙基-1,3-二硫代異吲哚啉、雙環(huán)3,5,5-三甲基環(huán)己烯-2-烯酮等生成的雜環(huán)類物質(zhì)可能會作為反應(yīng)的中間產(chǎn)物,參與更多的反應(yīng)。4發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果表明,在金華火腿成熟中期的環(huán)境條件下,蛋氨酸、半胱氨