第三章 基因工程常用的克隆載體

第三章基因工程常用的克隆載體第1頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件第2頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)質粒載體第3頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月一、質粒的定義

存在于細胞質中的一類獨立于染色體，并能自主復制的遺傳成分（復制子）復制子:細胞內獨立存在的、能夠自我增殖的結構單位染色體DNA質粒DNA噬菌體DNA第4頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒DNA編碼的表型抗性特性抗生素抗性：重金屬抗性：毒性陰離子：其他：AmprCmlrKanrStrrTetrHg、Ni、Co、Pd、Zn砷酸鹽、亞砷酸鹽、硼酸鹽、鉻酸鹽嵌入試劑（EB、吖啶）、輻射、噬菌體代謝特性：修飾寄主生活方式：植物冠癭病、發(fā)根病冠癭堿代謝第5頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月二、質粒DNA分子的特性結構特性SC型共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA，covalentlyclosedcircularDNA）OC型開環(huán)DNA（ocDNA，opencircularDNA）

L型線性DNA（L-DNA，lineDNA）第6頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月染料結合特性：

呈平面結構的染料（EB）可平嵌入DNA雙鏈堿基對之間。cccDNA由于結構緊密，自由末端較少，可結合染料EB分子比L-DNA少，因此密度較大。提取純化質粒DNA：氯化銫-溴乙錠密度梯度離心法（CsCl-EtBr）質粒DNA純度高、周期長、設備要求高、存在溴乙錠污染！第7頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月變性特性cccDNA由于分子較小且結構緊密，堿性條件下變性后，恢復pH條件即可復性。提取純化質粒DNA：微量堿變性法裂解菌體細胞加堿調pH至12～12.5DNA變性離心加NaAc調pH至4.8去除蛋白質、RNA質粒DNA純度較低、周期較短！第8頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月復制特性拷貝數(shù)：生長在標準培養(yǎng)基條件下，每個細胞中所含有的質粒DNA分子的數(shù)目嚴緊型復制：1-2個松弛型復制：10-100個

制備質粒：寄主細胞培養(yǎng)基中加入蛋白質合成抑制劑，增加質?？截悢?shù)！第9頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月三、質粒載體應具備的條件具有復制起始位點具有至少兩種易被檢測的選擇性標記具有多克隆位點（MCS）

多克隆位點（multi-cloning-site，MCS）：多種常用限制酶單一識別序列所組成的DNA序列具有盡可能小的相對分子質量易于分離純化目的DNA裝載能力強拷貝數(shù)高多重酶識別位點幾率低應屬于松弛型復制應為非傳遞型第10頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月四、幾種常用的質粒載體pBR322來源：大腸桿菌Ori：標記基因：apr、tcr分子大?。?363bp拷貝數(shù)：50-100/cellpBR3224363bpOriginofReplicationROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr第11頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC18來源：大腸桿菌Ori：標記基因：apr、lacZ’MCS：分子大?。?686bp拷貝數(shù)：1000-2000/cell第12頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)λ噬菌體載體第13頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月λ噬菌體DNA可以作為克隆載體的原因：高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增λDNA缺失達總量20%的DNA時，仍不影響其特性，可為外源基因提供裝載空間第14頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基本概念噬菌體感染周期：E.coli吸附注入復制包裝裂解整合溫和噬菌體烈性噬菌體原噬菌體營養(yǎng)體溶源菌溶菌途徑溶源途徑第15頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月二、λ噬菌體的形態(tài)結構及繁殖特性形態(tài)結構頭部：正二十面體、直徑約55nmλDNA：線性、約48kb尾部：長約150nm、粗12nm第16頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月繁殖特性λ噬菌體E.coli溶源菌裂解侵染渾濁噬菌斑第17頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月三、λDNA的結構及功能5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因(cΙ、cⅡ)早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNAANRJ左臂區(qū)：A→J中間區(qū)：J→N右臂區(qū)：N→R第18頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月cΙ基因：編碼阻遏蛋白，使參與溶菌周期活動的基因失活cΙ基因表達：溶源途徑cΙ基因不表達：溶菌途徑形成渾濁噬菌斑形成噬菌斑第19頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月四、λ噬菌體載體的構建消除多余的限制性內切酶位點點突變基因組置換、缺失增加單一酶切位點去除非必要區(qū)段λ噬菌體頭部蛋白可包裝DNA大?。?5～105%λDNA長度（38～52kb）增加篩選標記基因第20頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月五、λ噬菌體載體的主要類型插入型載體：

λDNA缺失部分非必要基因，只含有一個或兩個可供外源DNA插入的酶切位點特點：承載能力較小（<10kb）篩選標記：基因插入失活免疫功能失活的插入型載體β-半乳糖苷酶基因失活的插入型載體第21頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月表達阻遏蛋白免疫功能失活的插入型載體CΙ基因體外包裝插入片段CΙ基因不表達阻遏蛋白第22頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月β-半乳糖苷酶失活的插入型載體

表達酶LacZ基因無色混濁噬菌斑插入片段LacZ基因

不表達酶藍色混濁噬菌斑第23頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月替換型載體：

又稱取代型載體。在λDNA可替換片斷兩端具有兩個限制酶位點，酶切后可替換片斷與左右翼分開，由外源DNA片斷取代特點：承載能力大篩選標記：λDNA大小β-半乳糖苷酶基因替換第24頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月