第三章基因工程載體

第三章基因工程載體第1頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因克隆載體要讓一個(gè)從甲生物細(xì)胞內(nèi)取出來(lái)的基因在乙生物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，首先得將這個(gè)基因送到乙生物的細(xì)胞內(nèi)去。能將外源基因送入細(xì)胞的工具就是運(yùn)載體。基因克隆載體(DNA克隆載體)：通過(guò)不同途徑能將承載的外源DNA片段(基因)帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的DNA分子。第2頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能及特征一、發(fā)展概況

1.

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)

2.

第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。

3.第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。

第3頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件第4頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月載體應(yīng)具備的條件在克隆載體DNA分子合適的位置有一至多個(gè)克隆位點(diǎn)，供外源DNA片段組入克隆載體DNA分子。至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞?？寺≥d體必須是安全的。第5頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第6頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

質(zhì)?？寺≥d體第7頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌，偶見(jiàn)于鏈霉菌和酵母獨(dú)立于染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳,又依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。比病毒還簡(jiǎn)單的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一旦離開(kāi)寄主細(xì)胞則無(wú)法繁殖。第8頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能夠自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈的DNA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)，質(zhì)粒一般以超螺旋共價(jià)閉合環(huán)DNA分子（ccc-DNA）的形式存在。在體外理化因子作用下，質(zhì)?？梢猿蔀殚_(kāi)環(huán)DNA分子（oc-DNA）或線形DNA分子（l-DNA）。在變性條件下，質(zhì)?？沙蔀閱捂淒NA分子（ss-DNA）。質(zhì)粒DNA分子大小1-100Kb以上。第9頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒DNA的復(fù)制質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制復(fù)制方向性：純單向性（ColEI）；純雙向性（F質(zhì)粒）；既有單向又有雙向性（R6K）。根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1–數(shù)個(gè)拷貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10個(gè)拷貝以上stringentplasmid第10頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合ori

E.coliColE1

plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’第11頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制

控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep第12頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第13頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的不親和性有時(shí)也稱為不相容性，是指在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖構(gòu)成中，其中必然有一種會(huì)被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容第14頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第15頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒遷移革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用如Col、R的其它成員值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由bom和mob基因決定第16頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義第17頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒載體第18頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第19頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略1、能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制，并有較多的拷貝。2、含有盡可能多的克隆位點(diǎn)。3、含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。4、構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體DNA分子盡可能小。5、根據(jù)特殊需要，使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體中組裝各種“元件”（小DNA片斷），構(gòu)建成不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。第20頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過(guò)程的原則選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒（親本質(zhì)粒）。正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件。組裝合適的選擇標(biāo)記基因。選用合適的啟動(dòng)子。在能達(dá)到預(yù)期目的的前提下，構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建過(guò)程力求簡(jiǎn)單。第21頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322及其衍生質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建pBR322的構(gòu)建是質(zhì)粒載體構(gòu)建的一個(gè)典范。pBR322的親本質(zhì)粒pSF2124，含有Amp抗性基因pMB1，含有松弛型ColE1的復(fù)制起點(diǎn)（ori）Psc101，含有Tet抗性基因第22頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322及其衍生質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建1、在菌體內(nèi)將R1drd19質(zhì)粒（沙門氏菌中R1質(zhì)粒的一種變異體）的易位子Tn3（攜帶有Amp抗性基因）易位到pMB1質(zhì)粒上，構(gòu)成一個(gè)較大的質(zhì)粒pMB3(13.3Kb)。pMB3AATT黏性末端環(huán)化導(dǎo)入大腸桿菌pMB8(2.6Kb)EcoRI*第23頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、從質(zhì)粒pSC101獲得四環(huán)素抗性基因（Tetr)。獲得pMB9（5.3Kb)第24頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、向pMB9引入Amp抗性基因。pSF2124的Tn3體內(nèi)易位至pMB9獲得pBR312(10.2Kb,具有Amp抗性基因和Tet抗性基因）pBR312pBR313(8.8Kb，除去Amp抗性基因中的BamHI位點(diǎn)）EcoRI*第25頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、pBR313pBR322(4.3Kb)pBR320(2.8Kb)pBR318（6.3Kb)去除兩個(gè)PstIEcoRII片斷去掉酶切酶切體外重組第26頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第27頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、常用質(zhì)粒載體類型1、克隆質(zhì)粒載體2、表達(dá)質(zhì)粒載體3、多功能質(zhì)粒載體4、穿梭質(zhì)粒載體第28頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、克隆質(zhì)粒載體克隆質(zhì)粒載體是指專用于基因或DNA片斷無(wú)性繁殖的質(zhì)粒載體。pBR322質(zhì)粒pUC系列的質(zhì)粒載體第29頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pBR322質(zhì)粒具有較小的分子量，大小4363bp可以克隆大到6Kb的外源DNA片斷具有兩種選擇標(biāo)記，即Ampr和Tetr。具有多種限制性核酸內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)Amp抗性基因內(nèi)可被PstI,PvuI,SacI切開(kāi)，Tet抗性基因可被BamHI,HindIII切開(kāi)，通過(guò)插入失活篩選重組子。在宿主細(xì)胞內(nèi)具有較高的拷貝數(shù)。一般一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可達(dá)到15個(gè)，而在蛋白質(zhì)合成抑制劑存在條件下，可達(dá)到1000-3000拷貝，如氯霉素。第30頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CAPproteinbindingsite-591-554(compl.strand);mRNA(LacZ)startsatntposition507(compl.strand);lacrepressorbindingsite-507-487(compl.strand).第31頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pBR322插入失活效應(yīng)第32頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月篩選重組子的示意圖第33頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

BamHI片段(Tcr)

pBR322PstI(Apr)片段

重組分子I

重組分子Ⅱ(ApsTcr)(AprTcs）

PstI片段

外源DNABamHI片段利用抗生素抗性基因篩選重組子的過(guò)程重組分子I

涂布Ap平板Apr轉(zhuǎn)化子

分別轉(zhuǎn)化E.coli(ApSTcS)重組分子Ⅱ涂布Tc平板Tcr轉(zhuǎn)化子影印到Tc平板上AprTcS為重組子AprTcr為原載體

影印到Ap平板上ApSTcr為重組子即為非重組子第34頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pUC系列的質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原來(lái)限制性核酸內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ‘基因

位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位點(diǎn)(MCS，multiplecloningsites)區(qū)，但它并不破壞該基因的功能

第35頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第36頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MultipleCloningSitespUC18pUC19第37頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第38頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pUC系列質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)

具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)pUC8為2750bp，pUCl8為2686bppBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)的突變，導(dǎo)致rop基因的缺失適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體

LacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變株與帶有完整近操縱基因區(qū)段的β—半乳糖苷酶陰性的不同突變株之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，這種互補(bǔ)現(xiàn)象叫做α—互補(bǔ)。具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)pUC質(zhì)粒載體具有與M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點(diǎn)具兩種不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段，無(wú)需借助其它操作而直接克隆到pUC質(zhì)粒載體上第39頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第40頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月利用菌落顏色篩選重組子第41頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、表達(dá)質(zhì)粒載體是指專用于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體根據(jù)表達(dá)的蛋白是否分泌到細(xì)胞外：非分泌型表達(dá)載體（胞內(nèi)表達(dá)載體）和分泌型表達(dá)載體根據(jù)表達(dá)所用的受體細(xì)胞：原核細(xì)胞表達(dá)載體和真核細(xì)胞表達(dá)載體第42頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月表達(dá)載體與克隆載體的區(qū)別強(qiáng)啟動(dòng)子，一個(gè)可誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子可使外源基因有效的轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子下游區(qū)和ATG（起始密碼子）上游區(qū)有一個(gè)好的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD序列），促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個(gè)強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列，保證外源基因的有效轉(zhuǎn)錄和mRNA的穩(wěn)定性第43頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月表達(dá)型載體（expressionvector）

特點(diǎn)基因的啟動(dòng)子序列和終止子序列一般無(wú)檢測(cè)標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)是確定的（即位于啟動(dòng)子序列后）重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化單元--宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化表達(dá)單元--外源基因表達(dá)第44頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月表達(dá)型載體（expressionvector）

類型

Ⅰ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動(dòng)子）+終止子Ⅱ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+終止子Ⅲ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)+信號(hào)肽鏈編碼區(qū)+終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）第45頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三種表達(dá)型載體結(jié)構(gòu)圖第46頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月表達(dá)型載體（expressionvector）顯然,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之,被表達(dá)的外源基因一旦確定,表達(dá)載體的類型也就確定了。用途表達(dá)外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)第47頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、多功能質(zhì)粒載體載體具有多種功能，根據(jù)需要進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄、克隆、測(cè)序、基因表達(dá)等方面的基因操作。pGEM系列質(zhì)粒載體就是一類多功能載體，如：pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM4Z、pSP64、pSP65、pGEM3Zf。第48頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pGEM系列載體

pGEM系列載體是一種與pUC系列十分類似的小分子的質(zhì)粒載體。在其總長(zhǎng)度為2743bp的基因組DNA中，編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)lacZ’基因。在后者還插入了一段含多個(gè)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列的多克隆位點(diǎn)。此序列結(jié)構(gòu)幾乎與pUC克隆載體的完全一樣。第49頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pGEM3Z載體pGEM3Z與pUC載體非常相似

，其不同點(diǎn)：pGEM3Z含有兩段額外的短的DNA片段，每一段可以作為RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)。這兩段啟動(dòng)子（噬菌體SP6\T7)存在于限制性內(nèi)切酶的兩端，這意味著如果在重組的pGEM3Z載體中加入RNA聚合酶，可以發(fā)生轉(zhuǎn)錄。合成的RNA可以作為探針使用，或者研究RNA的加工過(guò)程或者蛋白質(zhì)的合成。第50頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第51頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2743bpMCSlacZ’PT7oriAprPgem-3EPSP6注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等第52頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第53頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、克隆載體，全長(zhǎng)3.19kb，具有Amp抗性基因和復(fù)制起始點(diǎn)2、MCS兩側(cè)有SP6、T7RNA聚合酶啟動(dòng)子---可進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；為插入片段的測(cè)序提供特異引物位點(diǎn)3、MCS為于lacZ’基因內(nèi)部（插入失活）—藍(lán)白斑篩選4、引入絲狀噬菌體f1(+)復(fù)制起始點(diǎn)-----可以產(chǎn)生單鏈DNA，并分泌至上清中，第54頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第55頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第56頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分泌型融合表達(dá)載體，有兩個(gè)啟動(dòng)子（Plac,Pspa），啟動(dòng)子下游裝有SPA的信號(hào)肽序列和兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因ZZ。產(chǎn)生與SPA蛋白ZZ段融合的蛋白，并可將融合蛋白分泌出胞4.59kb，含Amp抗性基因和原核復(fù)制起始點(diǎn)有f1復(fù)制起始點(diǎn)，可產(chǎn)生單鏈DNA第57頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、穿梭質(zhì)粒載體是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，因而可在兩種不同的宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。特點(diǎn)：質(zhì)粒載體可以攜帶外源DNA序列在不同物種的細(xì)胞之間，特別是在原核和真核之間往返穿梭。常見(jiàn)的穿梭質(zhì)粒載體：大腸桿菌-土壤農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體等。第58頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第59頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月穿梭質(zhì)粒

能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如既能在原核生物(如大腸桿菌)中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞(如酵母)中復(fù)制的載體。很多酵母菌的穿梭載體，用于功能互補(bǔ)法分離、鑒定真核生物基因的研究

第60頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)λ噬菌體載體第61頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、λ噬菌體的生物學(xué)特性λ噬菌體的生活周期λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)和功能λ噬菌體的DNA復(fù)制第62頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、λ噬菌體的生活周期l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成第63頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第64頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)和功能l-DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因線狀ds-DNA，兩端具有12bp5‘-突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’）該末端稱為cos位點(diǎn)，可被λ編碼的末端酶所識(shí)別第65頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第66頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第67頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)和功能人為將λ噬菌體基因組分為3個(gè)區(qū)域：左側(cè)區(qū)：自基因A到基因J，包含外殼蛋白的全部編碼基因。中間區(qū)：介于基因J和基因N之間，這個(gè)區(qū)又稱為非必需區(qū)，與噬菌斑形成無(wú)關(guān)，被外源DNA片斷取代后，并不影響噬菌體的生命活動(dòng)。中間區(qū)包含重組基因和一整合切割基因。右側(cè)區(qū)：位于N基因的右側(cè)，包含全部的主要調(diào)節(jié)基因及復(fù)制基因和裂解基因。第68頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、λ噬菌體的DNA復(fù)制裂解周期早期：環(huán)狀的λDNA分子按θ型雙向復(fù)制，復(fù)制起點(diǎn)位于O基因內(nèi)，需要O、P基因編碼蛋白的參與。晚期：控制滾環(huán)型復(fù)制的開(kāi)關(guān)被啟動(dòng)，復(fù)制從θ型轉(zhuǎn)變?yōu)闈L環(huán)型復(fù)制，合成出一系列λDNA線性排列的多聚體分子。cos位點(diǎn)是λ噬菌體正確包裝的必需位點(diǎn)。第69頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第70頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、λ噬菌體的DNA復(fù)制溶原性周期λDNA復(fù)制以另外一種形式進(jìn)行，穩(wěn)定的整合到宿主染色體上并隨之一起復(fù)制。cI基因表達(dá)，合成參與溶菌周期活動(dòng)的所有基因被阻遏的蛋白質(zhì)。附著位點(diǎn)att，同大腸桿菌染色體DNA的局部同源位點(diǎn)之間的重組反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。原噬菌體的刪除作用整合作用需要int基因的表達(dá)，是一種可逆的過(guò)程：一方面，噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體DNA上，成為原噬菌體；另一方面，在適當(dāng)條件下，原噬菌體又可以脫離宿主主染色體，重新變成獨(dú)立的復(fù)制子，這種過(guò)程叫做原噬菌體的刪除作用。λ噬菌體的刪除，需要噬菌體xis基因和int基因的協(xié)同作用才能實(shí)現(xiàn)。第71頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、

λ噬菌體載體的構(gòu)建（一）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本原理（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容1、除去多余的限制酶識(shí)別位點(diǎn)2、切除掉λDNA的非必需區(qū)3、引入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記4、引入無(wú)義突變第72頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本原理野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因λDNA基因組中同一種限制酶具有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，不利于外源DNA插入—體內(nèi)突變和建立新的克隆位點(diǎn)。λ噬菌體頭部只能容納自身DNA的75-105%，即39-52.5Kb，天然λ僅可插入2.5Kb外源DNA片段—除去所有與λ裂解無(wú)關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入22Kb。第73頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第74頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容1、除去多余的限制酶識(shí)別位點(diǎn)天然的λ-DNA上有多個(gè)酶切位點(diǎn)，如：EcoRI5個(gè)，HindIII7個(gè)，這些多余的酶切位點(diǎn)必須被修飾。一般利用自然選擇法獲得限制性位點(diǎn)缺失的λ品系。自然選擇法可以利用一個(gè)產(chǎn)生EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細(xì)胞的λDNA分子會(huì)被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其EcoRI位點(diǎn)缺失了。第75頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月通過(guò)自然選擇法篩選無(wú)EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的λ-噬菌體

第76頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容插入型載體只具有一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)可供外源DNA插入的λ噬菌體派生載體承載10Kb以內(nèi)外源DNA片斷取代型載體具有兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，它們之間的DNA片斷可被外源DNA片斷取代承載20Kb左右外源DNA片斷有多克隆位點(diǎn)，即可用作插入型又可用作取代型第77頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長(zhǎng)度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度插入型載體第78頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長(zhǎng)度10kb（51–26）載體長(zhǎng)度26kb插入片段最大裝載長(zhǎng)度25kb（36–26）l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度取代型載體第79頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容2、切除掉λDNA的非必需區(qū)載體經(jīng)改造后的長(zhǎng)度約為40kb，但在非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個(gè)相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長(zhǎng)，使用時(shí)用酶切開(kāi)，分離去除這個(gè)14kb長(zhǎng)的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。40-14kb=26kb包裝下限為36.4kb，因此其載裝下限為10.4而上限為25.5kb。不再需要標(biāo)記基因，因?yàn)榭蛰d的載體DNA只有26kb，不可能被包裝，因而無(wú)法進(jìn)入受體細(xì)胞中去第80頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容3、引入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記通過(guò)組織化學(xué)方法進(jìn)行重組子的篩選加裝選擇標(biāo)記lacZ不同的噬菌斑形態(tài)可作為篩選重組子的標(biāo)記imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑第81頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容4、引入無(wú)義突變琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株第82頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、常用的λ噬菌體載體插入滅活型載體

Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），這種生長(zhǎng)抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個(gè)基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑第83頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第84頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第85頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)單鏈DNA噬菌體載體優(yōu)越性能克隆較大的DNA片斷，包裝M13DNA的6倍產(chǎn)生大量含有外源DNA序列的單鏈DNA分子測(cè)定外源DNA片斷的插入方向可從大腸桿菌中制備雙鏈的復(fù)制型DNA兩種形式的DNA分子都能夠轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌，或產(chǎn)生噬菌斑第86頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、M13噬菌體的生物學(xué)特性（一）M13噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)（二）M13噬菌體感染、復(fù)制及包裝第87頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）M13噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ編碼特異性蛋白質(zhì)，參與病毒顆粒的組裝基因Ⅱ參與DNA復(fù)制基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ編碼M13的結(jié)構(gòu)蛋白基因Ⅴ參與單鏈復(fù)制過(guò)程中的環(huán)化作用基因Ⅵ是衣殼蛋白的重要組成部分第88頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker第89頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）M13噬菌體感染、復(fù)制及包裝復(fù)制過(guò)程：ss（+）RF(0-1min)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min→∞)DNA包裝無(wú)嚴(yán)格限制第90頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV感染周期第91頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第92頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、M13噬菌體載體的構(gòu)建M13-DNA上幾乎沒(méi)有非必需區(qū)域，因而載體的構(gòu)建主要是插入標(biāo)記基因如，lacZ'、多克隆位點(diǎn)，消除多余的酶切位點(diǎn)。在M13上引入lacZ’基因，產(chǎn)生了M13mp1，這樣就可以通過(guò)插入失活鑒定重組噬菌斑。

M13mp1載體不含有任何的單一切點(diǎn)的的識(shí)別序列，在基因的起始端，含有6堿基的序列GCATTC，是一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，這是通過(guò)體外定點(diǎn)突變獲得的，產(chǎn)生了M13mp2。M13mp2是最簡(jiǎn)單的M13克隆載體，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位點(diǎn)，在X-gal培養(yǎng)基上可以很容易的區(qū)別出來(lái)。

M13載體的構(gòu)建的第二步是將限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)引入lacZ’基因，這一步是通過(guò)合成短的多聚核苷酸稱為polylinker，含有一系列的限制性位點(diǎn)和EcoRI粘端，完成的。多聚接頭插入到M13mp2的EcoRI位點(diǎn)上，就產(chǎn)生了M13mp7。第93頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第94頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第95頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第96頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CoordinatesofM13mp18/19genes(terminationcodonsincluded):I3196-4242

II6849-831

III1579-2853

IV4220-5500

V843-1106

VI2856-3194

VII1108-1209

VIII1301-1522

IX1206-1304

X496-831M13mp18M13mp19第97頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、M13噬菌體載體的主要功能最為顯著的優(yōu)點(diǎn)是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈，用途：

（1）用于雙脫氧末端終止測(cè)定DNA順序

（2）用于單鏈DNA的定點(diǎn)誘變

（3）用于合成探針第98頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第99頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、噬菌粒（Phagemid）載體

質(zhì)粒與M13-DNA的重組體帶有質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)及標(biāo)記基因，這樣更于篩選及克隆由于不含包裝蛋白基因，載體本身長(zhǎng)度減少，裝載量增大，比質(zhì)粒大，但不及λ-DNA。第100頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第101頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第102頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第103頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)粘粒載體（cos質(zhì)粒載體）第104頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)粘粒載體（cos質(zhì)粒載體）l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有l(wèi)-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體第105頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)粘粒載體（cos質(zhì)粒載體）能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞第106頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第107頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第108頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)其他載體一、人工染色體二、植物基因工程載體三、動(dòng)物基因工程載體第109頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酵母人工染色體第110頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌人工染色體

YAC可接受100-1000kb的外源DNA片段，這一特點(diǎn)使YAC成為人類基因組計(jì)劃及圖位克隆分離基因的重要工具第111頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌人工染色體YAC載體應(yīng)含有下列元件：酵母染色體的端粒序列酵母染色體的復(fù)制子酵母染色體的中心粒序列酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子大腸桿菌的選擇標(biāo)記YAC載體的裝載量為100-2000kbpYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1第112頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉(zhuǎn)化酵母菌重組酵母染色體第113頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌人工染色體很多真核生物基因長(zhǎng)度在50kb以上。細(xì)菌人工染色體(BAC)載體就是為克隆更大的外源DNA片段而設(shè)計(jì)構(gòu)建的

細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300kb之間第114頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月載體容量M13mp載體<4kb細(xì)菌質(zhì)粒載體<10kbλ載體<23kbcos質(zhì)粒載體<48kbP1載體<95kbpYAC載體∽1000kb

第115頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PlantcloningvectorsTi質(zhì)粒:侵染廣泛的雙子葉植物T-DNA或T-區(qū)(T-region)：約20kb，包含?；诎`堿生化合成和冠癭瘤生長(zhǎng)的基因，隨機(jī)地整合到植物染色體上。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：兩端具有25個(gè)堿基對(duì)的順向重復(fù)序列，但重復(fù)不是完全的。25個(gè)堿基對(duì)的序列稱為T-DNA的邊界序列(T-DNAbordersequence)。去除右邊界序列，將使T-DNA失去轉(zhuǎn)移和整合的功能；左邊界的缺失，對(duì)致瘤性無(wú)明顯影響。毒性區(qū)域即vir(virulence)區(qū)域:引起T-DNA轉(zhuǎn)移的區(qū)域。長(zhǎng)度約35kb，和T-DNA處于不同位置第116頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒包括五個(gè)區(qū)域1.LB與RB之間的T-DNA，這段序列整合到植物基因組中2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(PT)3.冠癭堿代謝區(qū)4.復(fù)制原點(diǎn)5.毒性區(qū)第117頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒及其衍生載體T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將細(xì)菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到這個(gè)區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。Vir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉(zhuǎn)移。第118頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒是約200-500kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用，故需對(duì)其加以改造，構(gòu)建出Ti質(zhì)粒的衍生載體系統(tǒng)，廣泛用作植物基因工程中的載體：（1）雙元載體(binaryvectors）如pBin19載體，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作為細(xì)菌選擇標(biāo)記，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作為植物的選擇標(biāo)記，pUC19的多克隆位點(diǎn)及α-互補(bǔ)顯色標(biāo)記（2）共整合載體(integratedvectors)第119頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CaMV克隆載體含1個(gè)約8kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子；用于十字花科和少數(shù)非十字花科的植物基因轉(zhuǎn)移；其感染對(duì)植物有害，不能直接做載體；CaMV的DNA在植物細(xì)胞中能高水平轉(zhuǎn)錄35SRNA，其啟動(dòng)子是一強(qiáng)啟動(dòng)子。構(gòu)建的含35S啟動(dòng)子的系列克隆載體可在植物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)基因。第120頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第121頁(yè)，課件共129頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Cloningvectorsofanimalcell動(dòng)物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物5243bp共價(jià)閉合環(huán)狀分子感染率高，幾乎100％寄主細(xì)胞能被感染能提供完整的真核基因轉(zhuǎn)錄所需的成分侵染性具有寄主特異性改建：野生型最多只能包裝其基因組長(zhǎng)度的1.05倍的DNA分子其他：痘苗病毒DNA作載