參元丹膠囊對動脈內(nèi)皮損傷大鼠血漿e、angii、nos的影響

參元丹膠囊對動脈內(nèi)皮損傷大鼠血漿e、angii、nos的影響

參元丹（syd）是根據(jù)不穩(wěn)定型心絞痛（unstab.a）缺血性抑郁綜合征患者的臨床特征設(shè)計(jì)的處方。根據(jù)以往的研究，氣虛血虛的臨床治療具有良好的臨床療效。療效機(jī)制可能與其調(diào)整UA患者血管內(nèi)皮功能,促進(jìn)纖溶功能有關(guān)。本研究觀察參元丹對動脈內(nèi)皮損傷大鼠血漿內(nèi)皮素(ET)、血管緊張素Ⅱ(AngII)及血清一氧化氮合酶(NOS)的影響,以進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制,為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。儀器與檢測方法1.實(shí)驗(yàn)動物健康成年Wistar大鼠80只,雌雄各半,體質(zhì)量(396±29)g,鼠齡4月左右,清潔級。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,動物合格證號:SCXK(京)2002-0014。大鼠飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在北京市中醫(yī)研究所清潔級實(shí)驗(yàn)動物室內(nèi)進(jìn)行。2.藥物參元丹,藥物組成:黃芪、黨參、土元、水蛭、玄參、丹參、延胡索、地龍等。將組成藥物以10倍量常水煮提3次,每次30min,合并煮提液,濃縮至每毫升內(nèi)含生藥1g的清膏供用。由北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供,為北京市藥監(jiān)局備案制劑,批準(zhǔn)文號為(99)京衛(wèi)藥制字第F-2037號。通心絡(luò)膠囊主要組成:人參、水蛭、全蝎、蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍藥、冰片等。生產(chǎn)廠家:石家莊以嶺藥業(yè)有限公司生產(chǎn),每粒0.38g,生產(chǎn)批號9906115。合心爽30mg/片,天津田邊制藥有限公司生產(chǎn),批號津衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1993)第002430號。3.藥品、試劑與儀器、材料3.1藥品戊巴比妥鈉,BDH,AR級,使用前用滅菌注射用水配制成3%的濃度。高滲液制備:將Krebs溶液(1)中各成分增加20%以配成高滲液。成分如下(mmol/L):NaCl113.75(94.79)、KCl5.63(4.69)、CaCl26.07(5.06)、KH2PO41.42(1.18)、MgSO4·7H2O1.28(1.07)、NaHCO329.99(24.99)、glucose13.32(11.10)【注:()內(nèi)為等滲Krebs溶液】。碘酒、10%中性甲醛,無水乙醇,95%乙醇,75%乙醇,蘇木素染色劑,伊紅染色劑,石蠟。3.2試劑與儀器ET測定按ET放免藥盒(由北京北方生物技術(shù)研究所提供)操作程序進(jìn)行。可測范圍為20-1620pg/ml,靈敏度為10pg/ml,批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為<5%,<10%。NOS采用比色法,藥盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供,測定按說明書操作程序進(jìn)行。AngII測定按AngII放免藥盒(由北京北方生物技術(shù)研究所提供)操作程序進(jìn)行。可測范圍為25-800pg/ml,靈敏度為10pg/ml,批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為<10%,<15%。所用儀器:721型光柵分光光度計(jì)、DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽,上海醫(yī)用電子儀器廠生產(chǎn);FT-646A型微機(jī)放免儀,北京核儀器廠生產(chǎn);低速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);德國來卡脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī);光學(xué)顯微鏡;北航三高CMIAS99C型彩色病理圖像分析儀。3.3材料改良F2硬脊膜外麻醉導(dǎo)管:將F2硬脊膜外麻醉導(dǎo)管[武進(jìn)市政平乳膠制品廠生產(chǎn),批號:國藥管械(準(zhǔn))字2002第3660060號,蘇藥管械生產(chǎn)許20010178號,Q/320483ZR2001-2001,蘇衛(wèi)消字(2000)第3073號]前端1cm處的兩端用4號半針頭刺穿4-6個小孔,導(dǎo)管后連接1ml注射器。醫(yī)用手術(shù)器械:剪刀、眼科剪刀、鑷子、止血鉗、醫(yī)用縫合線、酒精、碘酒等。4.實(shí)驗(yàn)動物模型制備在參照唐朝樞及其他文獻(xiàn)報告方法的基礎(chǔ)上結(jié)合本院具體條件,改良并初步建立動脈內(nèi)皮損傷大鼠模型。用3%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉大鼠后,將動物背位固定在鼠臺上,除去頸部局部鼠毛,皮膚用碘酒和酒精常規(guī)消毒后,剪開皮膚約2-3cm長,依次分離皮下組織、肌肉并暴露氣管,在氣管左側(cè)游離左頸總動脈1-1.5cm,將遠(yuǎn)心端結(jié)扎,近心端用動脈鉗閉夾,于頸動脈遠(yuǎn)端用動脈剪剪一斜口,將導(dǎo)管插入胸主動脈約4-5cm長,反復(fù)牽拉5次,第6次插入胸主動脈后注入高滲液0.1ml保留90s,最后拔出導(dǎo)管,結(jié)扎左側(cè)頸總動脈,逐層縫合皮下脂肪、肌肉及皮膚切口,碘酒涂擦切口。5.分組及給藥、處理方法適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后,先取10只大鼠進(jìn)行病理模型造模預(yù)實(shí)驗(yàn),經(jīng)病理證實(shí)造模成功后,將大鼠隨機(jī)分為7組,假手術(shù)組、參元丹高劑量組、參元丹低劑量組、通心絡(luò)組、合心爽組、正常對照組,病理模型組,每組10只。造模后常規(guī)飼養(yǎng)同時,參元丹低劑量組,給予參元丹清膏3.8g/(kg·d);參元丹高劑量組,給予參元丹清膏5.8g/(kg·d);通心絡(luò)組0.2g/(kg·d);合心爽組2.5mg/(kg·d);連續(xù)給藥14天。假手術(shù)組、正常對照組、病理模型組用飲用水灌胃14天。標(biāo)本留取方法:各組于造模后第14天處死動物,取實(shí)驗(yàn)大鼠靜脈血,分離血清和血漿,分別檢測NOS、ET、AngII。動脈留取時剖開頸部,游離頸總動脈,向心端依次留取胸主動脈損傷血管病理標(biāo)本1-2cm長,分別放入10%中性甲醛固定備用。病理檢查:將病理標(biāo)本在10%中性甲醛液中固定24h后,逐級乙醇脫水,石蠟包埋,間斷均勻切片(每片厚5μm),制成組織切片備檢。對病理切片進(jìn)行常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察受損血管病理組織形態(tài)學(xué)改變,同時病理科協(xié)同采用彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,測定血管內(nèi)膜厚度。6.統(tǒng)計(jì)分析方法數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,利用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組間比較用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組血漿et、nos、angii水平各組藥物對動脈內(nèi)皮損傷大鼠血清NOS,血漿ET、AngII的影響,見表1。ET:與正常對照組相比較,病理模型組明顯升高,兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與病理模型組比較,SYD高低劑量組、合心爽及通心絡(luò)組均能夠抑制ET水平的升高,與病理模型組之間均有顯著性差異。與通心絡(luò)組比較,參元丹高、低劑量組抑制ET水平作用更加明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NOS:與正常對照組相比較,各組的NOS均有升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與病理模型組相比,各治療組均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ET/NOS:與正常對照組相比較,病理模型組呈明顯升高,兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與病理模型組比較,SYD高、低劑量組、合心爽及通心絡(luò)組均可抑制ET/NOS比值的升高,差異具有顯著性意義。SYD低劑量組與合心爽組ET/NOS比值低于正常對照組,差異有顯著性意義。與通心絡(luò)組比較,參元丹低劑量組降低ET/NOS比值作用更加明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AngII:與正常對照組相比較,病理模型組的AngII有升高趨勢,但兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與病理模型組比較,SYD高、低劑量組及通心絡(luò)、合心爽對照組均可降低AngII水平,差異具有顯著性意義。結(jié)果亦顯示:與正常對照組相比,合心爽組,SYD高、低劑量組對血漿ET水平影響有顯著性意義;通心絡(luò)組、SYD低劑量組對血漿AngⅡ水平影響有顯著性意義,但是具體影響因素有待于進(jìn)一步分析研究。對血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)在心血管疾病動物模型的研究中,大鼠主動脈機(jī)械損傷模型廣泛應(yīng)用于動脈內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的研究。有文獻(xiàn)報告說剝脫內(nèi)皮細(xì)胞可用高濃度KCL,但其機(jī)制不明,且這種方法只有在剝脫冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞時使用。在查閱相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合已有實(shí)驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上,筆者建立大鼠主動脈內(nèi)皮損傷模型,研究中藥參元丹對大鼠動脈內(nèi)皮損傷后血清NOS、血漿ET、AngII水平的影響及動脈內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜的增生情況。血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcells,VECs)既是血管壁的重要組成部分,又作為龐大的內(nèi)分泌系統(tǒng)參與許多生理活動,它可以產(chǎn)生和分泌包括ET、NO、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)在內(nèi)的幾十種生物活性物質(zhì),調(diào)節(jié)血管的舒縮狀態(tài),防止血小板黏附和血栓形成,調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞生長和增殖,防止炎細(xì)胞浸潤和有害物質(zhì)滲入。研究表明內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化的始動因素,內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在冠心病發(fā)病過程中起著重要作用。內(nèi)皮分泌的心血管活性物質(zhì),如NO、ET、AngⅡ等對心血管系統(tǒng)功能具有重要調(diào)節(jié)作用,并參與多種心血管疾病的病理生理過程。生理情況下,內(nèi)皮分泌的ET具有縮血管效應(yīng),在ET產(chǎn)生的同時血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮舒張因子(EDRF),使血管平滑肌舒張,制約其效應(yīng)。但是在病理狀態(tài)下,如動脈內(nèi)皮損傷后,血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,血管內(nèi)皮收縮因子(EDCF)/EDRF之間的平衡被打破,縮血管物質(zhì)ET釋放比例增加,出現(xiàn)強(qiáng)烈的縮血管反應(yīng)。AngⅡ經(jīng)內(nèi)皮釋放,可直接作用于血管平滑肌細(xì)胞,引起血管收縮。NO是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的擴(kuò)血管因子,是NOS將L-精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)長-胍氨酸過程中的氧化產(chǎn)物,NO在體內(nèi)代謝速度快,半衰期很短,難以直接測量,測定NO代謝產(chǎn)物及NO合成酶的濃度可反映內(nèi)生性NO的變化。NO/ET兩者共同維持血管張力,調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能。內(nèi)膜過度增生增厚是造成血管狹窄和導(dǎo)致管腔面積縮小的重要病理機(jī)制。主動脈內(nèi)皮損傷后關(guān)于內(nèi)膜增殖的確切機(jī)制至今尚未完全闡明。近年來的研究發(fā)現(xiàn),AngII能通過其I型受體激活黏著斑激酶(focaladhesioninase,FAK),促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移;同時ET-1尚可促進(jìn)有絲分裂作用,使血管平滑肌增生。參元丹在益氣扶正基礎(chǔ)上,選用破血逐瘀之品,力求破血而不傷正。方中黃芪益氣扶正,水蛭破血逐瘀,共為主藥;黨參補(bǔ)中益氣,土鱉蟲攻血破堅(jiān),共為輔藥;地龍行經(jīng)通絡(luò),玄參育陰軟堅(jiān),丹參養(yǎng)血活血,延胡索行氣活血止痛,共為佐使。合方共奏益氣破血、滋陰養(yǎng)血、行氣通絡(luò)之效。筆者既往的臨床研究提示,參元丹及合心爽對UA血瘀證患者均有較好的臨床效果,但參元丹在改善患者全身癥狀方面較合心爽更具優(yōu)勢。動物實(shí)驗(yàn)顯示,參元丹對內(nèi)皮完整及去內(nèi)皮家兔主動脈環(huán)鹽酸去氧腎上腺素(phenylephrinehydrochloride,PHE)引起的收縮均有拮抗作用,對內(nèi)皮完整動脈環(huán)作用明顯強(qiáng)于去內(nèi)皮動脈環(huán),提示參元丹對血管環(huán)的收縮拮抗作用可能部分需要內(nèi)皮功能的參與。筆者另外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SYD在明顯降低大鼠急性心肌缺血時血漿ET水平的同時,能提高其NOS的水平,調(diào)節(jié)血管收縮/舒張的平衡,這也與某些活血化瘀中藥抗心肌缺血實(shí)驗(yàn)結(jié)果相接近。同期動脈內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜的增生研究顯示,參元丹可抑制動脈內(nèi)皮損傷后血管內(nèi)膜過度增生,對血管內(nèi)皮功能具有一定的保護(hù)作用。本研究