應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生乳中細(xì)菌計(jì)數(shù)的方法

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生乳中細(xì)菌計(jì)數(shù)的方法

生育性乳（乳）是由健康奶動(dòng)物擠下的普通乳液，只能通過(guò)冷卻和過(guò)濾，但不能經(jīng)過(guò)消毒。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)“rawmilk”并沒(méi)有統(tǒng)一的命名。本文以中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T939-2005的命名為準(zhǔn)。生乳中微生物數(shù)量會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量、貨架期及生產(chǎn)流程的安全性。微生物的檢測(cè)方法有很多種。傳統(tǒng)的平皿計(jì)數(shù)法是應(yīng)用最廣泛的,但該方法耗時(shí)長(zhǎng),不能及時(shí)檢測(cè)不易繁殖的細(xì)菌。近年來(lái),微生物的快速檢測(cè)得到了很大的發(fā)展,比較成熟的有化學(xué)發(fā)光法、ATP生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計(jì)數(shù)法等。但這些方法還存在很多的缺陷,如檢測(cè)限高、精確度低和費(fèi)用昂貴。流式細(xì)胞儀是一款功能強(qiáng)大的細(xì)胞分析、計(jì)數(shù)設(shè)備。它兼具準(zhǔn)確性高、分析快速的優(yōu)點(diǎn)。由于生乳的成分復(fù)雜,干擾因素多,導(dǎo)致流式細(xì)胞儀還不能對(duì)生乳進(jìn)行微生物檢測(cè)。本文對(duì)生乳中干擾物質(zhì)的前處理方法進(jìn)行了研究,初步建立了流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)生乳中細(xì)菌總數(shù)的方法,并和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法進(jìn)行比較,進(jìn)行了準(zhǔn)確性和靈敏度的驗(yàn)證。1材料和方法1.1菌株和儀器UHT乳超市出售的某一品牌產(chǎn)品;生乳私營(yíng)奶戶提供;蛋白酶K、碘化丙錠(PI)、胰蛋白酶、TritonX-100等購(gòu)于Sigma公司;大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。EPICSXL型流式細(xì)胞儀Beckman-coulter公司;透明循環(huán)水浴槽上海一恒科技有限公司;生物安全柜、生化培養(yǎng)箱北京市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1樣品的制備1.2.1.coli和s.aureus在uht乳中的接種或S.aureus的UHT乳將E.coli或S.aureus在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)24h,按一定比例接種到UHT乳中,充分震蕩、混勻。1.2.1.沉淀細(xì)菌重新懸浮S.aureus的PBS菌懸液將E.coli或S.aureus在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)24h,14000×g離心5min,棄上清,加入0.1mol/LPBS(pH=7.2)使沉淀細(xì)菌重新懸浮。1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)目標(biāo)物的篩選、確認(rèn)研究表明,生乳中的蛋白質(zhì)顆粒、脂肪球、體細(xì)胞三種成分會(huì)干擾流式細(xì)胞儀對(duì)目標(biāo)物的分選、確認(rèn)。因此,樣品前處理以排除以上三種物質(zhì)的干擾為目標(biāo)。1.2.2.細(xì)菌的熱處理和沉淀物的分離蛋白質(zhì)的處理取已接種E.coli或S.aureus的UHT乳200μL于EP管中,加胰蛋白酶0.3mg,50℃消化20min,使UHT乳中的蛋白質(zhì)水解。細(xì)菌的熱處理再向EP管中加800μL0.1mol/LPBS,100℃沸水浴10min。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行熱處理,增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,破損細(xì)菌細(xì)胞膜,細(xì)菌形態(tài)完整,細(xì)菌內(nèi)DNA沒(méi)有溢出。脫脂及富集細(xì)菌14000×g離心5min,微量進(jìn)樣器小心移去脂肪層和上清,沉淀物即為細(xì)菌。細(xì)菌懸液的制備向EP管中加190μL的0.1mol/LPBS(pH=7.2),使沉淀的細(xì)菌重新懸浮。1.2.2.細(xì)菌的熱處理雜質(zhì)的去除取一定量生乳用300目尼龍膜過(guò)濾,去除雜質(zhì)。蛋白質(zhì)及體細(xì)胞的處理取過(guò)濾后的生乳200μL置于EP管中,加蛋白酶K(20mg/mL)5μL、10%TritonX-1001μL,50℃消化15min。實(shí)驗(yàn)用蛋白酶K水解生乳中的蛋白質(zhì);用TritonX-100裂解體細(xì)胞,TritonX-100能夠破碎體細(xì)胞的細(xì)胞膜,使其內(nèi)容物溶出,從而達(dá)到裂解體細(xì)胞的作用。細(xì)菌的熱處理再向EP管中加800μL0.1mol/LPBS;100℃沸水浴10min。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行熱處理,增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,破損細(xì)菌細(xì)胞膜,細(xì)菌形態(tài)完整,細(xì)菌內(nèi)DNA沒(méi)有溢出。脫脂及富集細(xì)菌14000×g離心5min,微量進(jìn)樣器小心移去脂肪層和上清,沉淀物即細(xì)菌。細(xì)菌懸液的制備向EP管中加190μL的0.1mol/LPBS(pH=7.2),使沉淀的細(xì)菌重新懸浮。1.2.3檢測(cè)波長(zhǎng)和波長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)采用PI進(jìn)行菌體染色,PI能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA嵌合,對(duì)核酸并無(wú)特異性選擇。其激發(fā)波長(zhǎng)488mn,發(fā)射波長(zhǎng)620mn。它可以標(biāo)記所有的細(xì)菌,但是PI不能穿透活細(xì)菌的細(xì)胞膜,它只能在細(xì)菌細(xì)胞膜破損的情況下進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)。實(shí)驗(yàn)采用100℃加熱10min對(duì)細(xì)菌進(jìn)行熱處理,破壞其細(xì)胞膜,使PI染料能夠順利進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)染色DNA。染色方法:取PI染液(20μg/mL)10μL,加入到經(jīng)過(guò)前處理的樣品中,避光染色5min。1.2.4檢測(cè)結(jié)果和討論流式細(xì)胞儀的分析原理:制備好的單細(xì)胞懸液通過(guò)樣本管被壓進(jìn)噴嘴的中央,同時(shí)無(wú)細(xì)胞的鞘液也被壓入噴嘴,形成包繞細(xì)胞的鞘液流,使細(xì)胞以單列進(jìn)入流動(dòng)室,與水平方向的激光光束(為488nm的氬離子激光)垂直相交。穩(wěn)定的液流推進(jìn)裝置使樣本呈單列,每個(gè)細(xì)胞以均等的時(shí)間依次通過(guò)激光照射區(qū),被熒光染色的細(xì)胞受照射后,產(chǎn)生兩種信號(hào),一種是散射光信號(hào),又分為前向散射光(Forwardscatter,FSC),一般與細(xì)胞體積的大小呈正比;側(cè)向散射光(Sidescatter,SSC),與細(xì)胞的顆粒度和復(fù)雜性有關(guān)。另一種為熒光信號(hào),發(fā)射的熒光與結(jié)合位點(diǎn)呈正比。不同類型的光信號(hào)被相應(yīng)的光學(xué)檢測(cè)器接收。光學(xué)信號(hào)經(jīng)電學(xué)系統(tǒng)采集,轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼W(xué)信號(hào),經(jīng)專業(yè)軟件處理,得出檢測(cè)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中將經(jīng)過(guò)前處理、染色的樣品200μL移入流式管中,0.1mol/LPBS適當(dāng)稀釋。利用EXPO32ADC操作系統(tǒng)進(jìn)行分析,檢測(cè)時(shí)間為60s。表1為流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析的參數(shù)設(shè)置。1.2.5平床消毒實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行微生物檢測(cè)的對(duì)照方法采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌落總數(shù)測(cè)定,GB4789.2-2003。1.2.6統(tǒng)計(jì)分析使用SAS6.12軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果與討論2.1uht乳的染色及流式分析實(shí)驗(yàn)將E.coli和S.aureus分別代表可能污染生乳的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。將E.coli或S.aureus的PBS菌懸液100℃沸水浴10min,PI染色后進(jìn)行流式分析。結(jié)果如圖1A和圖1B所示,圖中分別顯示出了菌群E.coli和S.aureus在直方圖中的位置。對(duì)于熒光特性和顆粒度性質(zhì)相同的物質(zhì),它們?cè)诹魇綀D譜中所處的位置是相對(duì)不變的。被熒光PI染色的細(xì)菌,它在熒光通道FL3內(nèi)的強(qiáng)度應(yīng)大于100,說(shuō)明熒光強(qiáng)度呈陽(yáng)性反映。而體現(xiàn)細(xì)菌顆粒度的參數(shù)SS也應(yīng)處于相對(duì)固定的范圍內(nèi)。將含E.coli的UHT乳只進(jìn)行100℃沸水浴10min的熱處理,PI染色后流式分析的結(jié)果如圖1C。在圖1C中可以看出E.coli沒(méi)有出現(xiàn)在指定位置,顆粒度偏大,而熒光信號(hào)也處于100以內(nèi)的陰性區(qū)間。這可能是由于脂肪球和蛋白質(zhì)顆粒的存在能夠?qū)е聼晒馊玖系姆翘禺愋匀旧?同時(shí)也影響細(xì)菌的染色。把含有E.coli的UHT乳進(jìn)行脫脂處理,蛋白質(zhì)顆粒同樣會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生不良影響(圖1D)。將含有E.coli或S.aureus的UHT乳進(jìn)行完整前處理,PI染色后進(jìn)行流式分析,結(jié)果如圖1E和圖1F所示,細(xì)菌群在直方圖中又出現(xiàn)在了正確的位置,E.coli和S.aureus的熒光信號(hào)均大于100,呈陽(yáng)性反映,顆粒度也處在合理的范圍內(nèi)。這說(shuō)明前處理方案成功的排除了乳中大顆粒物質(zhì)對(duì)流式細(xì)胞儀分析所帶來(lái)的干擾,使細(xì)菌能夠正常被染色、分析。對(duì)于UHT乳樣品實(shí)驗(yàn)采用酶底比5%的胰蛋白酶處理,而處理生乳采用終濃度為0.5mg/mL的蛋白酶K處理。這是由于經(jīng)超高溫處理的生乳會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,破壞了蛋白質(zhì)顆粒的結(jié)構(gòu),使胰酶可以比較容易的裂解蛋白。而胰蛋白酶在短時(shí)間內(nèi)對(duì)生乳中蛋白質(zhì)顆粒起不到很好的消化效果。蛋白酶K性能優(yōu)越,在15min內(nèi)可以很好的消化生乳中未變性蛋白質(zhì)顆粒。2.2uht乳前處理將含有S.aureus的UHT乳樣品進(jìn)行不完整的UHT乳前處理(不進(jìn)行細(xì)菌熱處理),另取含有S.aureus的UHT乳樣品進(jìn)行UHT乳前處理,結(jié)果分別為圖2A和圖2B。如圖所示,對(duì)于未進(jìn)行熱處理的S.aureus樣品,PI無(wú)法對(duì)細(xì)菌染色,細(xì)菌的熒光信號(hào)全部處于陰性區(qū)間;而經(jīng)過(guò)熱處理的樣品,PI能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜染色DNA,在熒光通道FL3內(nèi)幾乎所有菌體的熒光信號(hào)均顯示為陽(yáng)性。2.3流式細(xì)胞術(shù)和平餅菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果將E.coli和S.aureus于營(yíng)養(yǎng)肉湯中過(guò)夜培養(yǎng),分別以103~108/mL的接種量添加到UHT乳中。分別用流式細(xì)胞術(shù)、平皿菌落計(jì)數(shù)法對(duì)各梯度樣品進(jìn)行檢測(cè)(圖3)。對(duì)兩種微生物的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,濃度范圍在104~108/mL內(nèi),流式細(xì)胞術(shù)與平皿菌落計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果呈正的直線相關(guān)(P<0.01),相關(guān)程度為顯著相關(guān)(rE.coli=0.9948,rS.aureus=0.9955)。對(duì)于細(xì)菌濃度為103/mL的樣品,檢測(cè)結(jié)果有較大偏差。2.4檢測(cè)上限的確定流式細(xì)胞術(shù)的最低檢出限為104/mL。由于EPICSXL型流式細(xì)胞儀每秒鐘最大的檢測(cè)值為4000個(gè)/s,因此理論上樣品濃度的檢測(cè)上限是2.4×107/mL。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果為2.4×107/mL的樣品,需要再將樣品按級(jí)稀釋,取檢測(cè)結(jié)果在2.4×107/mL以內(nèi)的稀釋度為準(zhǔn),再進(jìn)行換算。2.5生乳前處理方法將生乳樣品按生乳前處理方法進(jìn)行處理,PI染色后得到流式圖譜4A。圖中黑色框選區(qū)域內(nèi)表示的是細(xì)菌。與處理含有E.coli或S.aureus的UHT乳樣品不同,經(jīng)過(guò)處理的生乳樣品中仍含有較多的非菌體微粒,它們可能是由體細(xì)胞碎片、少數(shù)未分解的蛋白質(zhì)顆粒組成。體細(xì)胞中含有DNA,可以被PI染色而顯示出熒光特性,造成假陽(yáng)性結(jié)果。TritonX-100的作用就是破碎體細(xì)胞,使體細(xì)胞的DNA溢出。由于體細(xì)胞DNA的顆粒度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于細(xì)菌的顆粒度,這導(dǎo)致在直方圖上體細(xì)胞DNA的光信號(hào)不會(huì)與細(xì)菌的光信號(hào)出現(xiàn)在同一區(qū)域內(nèi),從而排除了體細(xì)胞的干擾。通過(guò)生乳前處理方法處理生乳樣品得到的結(jié)果表示的是乳液中所有菌體的數(shù)量,包括具有生命活力的細(xì)菌和已經(jīng)死亡的細(xì)菌。死亡細(xì)菌的區(qū)分方法如下:將生乳樣品進(jìn)行不完整的生乳前處理(不進(jìn)行細(xì)菌的熱處理)。這樣處理的生乳樣品,既去除了蛋白質(zhì)顆粒、脂肪球、體細(xì)胞的干擾,又保持了細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。由于死亡菌體溶脹,細(xì)菌細(xì)胞膜破裂,PI分子得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)染色DNA,其熒光特性為陽(yáng)性;而活細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,PI分子不能染色,其熒光特性為陰性(圖4B)。由圖4B顯示,該樣品中死亡細(xì)菌的百分率為4.2%。從細(xì)菌總數(shù)中除去死亡細(xì)菌百分率,即為活菌數(shù)。將生乳樣品(n=10)分別用流式細(xì)胞術(shù)、平皿菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌數(shù);再將同一個(gè)生乳樣品稀釋102倍,分別用流式細(xì)胞術(shù)、平皿菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌數(shù)。由圖5可以看出,流式細(xì)胞術(shù)與平皿菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)生乳中的細(xì)菌總數(shù)的結(jié)果呈正的直線相關(guān)(P<0.01),