應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測生乳中細(xì)菌計數(shù)的方法

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測生乳中細(xì)菌計數(shù)的方法

生育性乳（乳）是由健康奶動物擠下的普通乳液，只能通過冷卻和過濾，但不能經(jīng)過消毒。目前,國內(nèi)對“rawmilk”并沒有統(tǒng)一的命名。本文以中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T939-2005的命名為準(zhǔn)。生乳中微生物數(shù)量會影響產(chǎn)品的質(zhì)量、貨架期及生產(chǎn)流程的安全性。微生物的檢測方法有很多種。傳統(tǒng)的平皿計數(shù)法是應(yīng)用最廣泛的,但該方法耗時長,不能及時檢測不易繁殖的細(xì)菌。近年來,微生物的快速檢測得到了很大的發(fā)展,比較成熟的有化學(xué)發(fā)光法、ATP生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計數(shù)法等。但這些方法還存在很多的缺陷,如檢測限高、精確度低和費用昂貴。流式細(xì)胞儀是一款功能強大的細(xì)胞分析、計數(shù)設(shè)備。它兼具準(zhǔn)確性高、分析快速的優(yōu)點。由于生乳的成分復(fù)雜,干擾因素多,導(dǎo)致流式細(xì)胞儀還不能對生乳進行微生物檢測。本文對生乳中干擾物質(zhì)的前處理方法進行了研究,初步建立了流式細(xì)胞術(shù)快速檢測生乳中細(xì)菌總數(shù)的方法,并和國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進行比較,進行了準(zhǔn)確性和靈敏度的驗證。1材料和方法1.1菌株和儀器UHT乳超市出售的某一品牌產(chǎn)品;生乳私營奶戶提供;蛋白酶K、碘化丙錠(PI)、胰蛋白酶、TritonX-100等購于Sigma公司;大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室提供。EPICSXL型流式細(xì)胞儀Beckman-coulter公司;透明循環(huán)水浴槽上海一恒科技有限公司;生物安全柜、生化培養(yǎng)箱北京市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。1.2實驗方法1.2.1樣品的制備1.2.1.coli和s.aureus在uht乳中的接種或S.aureus的UHT乳將E.coli或S.aureus在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)24h,按一定比例接種到UHT乳中,充分震蕩、混勻。1.2.1.沉淀細(xì)菌重新懸浮S.aureus的PBS菌懸液將E.coli或S.aureus在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)24h,14000×g離心5min,棄上清,加入0.1mol/LPBS(pH=7.2)使沉淀細(xì)菌重新懸浮。1.2.2流式細(xì)胞儀檢測目標(biāo)物的篩選、確認(rèn)研究表明,生乳中的蛋白質(zhì)顆粒、脂肪球、體細(xì)胞三種成分會干擾流式細(xì)胞儀對目標(biāo)物的分選、確認(rèn)。因此,樣品前處理以排除以上三種物質(zhì)的干擾為目標(biāo)。1.2.2.細(xì)菌的熱處理和沉淀物的分離蛋白質(zhì)的處理取已接種E.coli或S.aureus的UHT乳200μL于EP管中,加胰蛋白酶0.3mg,50℃消化20min,使UHT乳中的蛋白質(zhì)水解。細(xì)菌的熱處理再向EP管中加800μL0.1mol/LPBS,100℃沸水浴10min。對細(xì)菌進行熱處理,增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,破損細(xì)菌細(xì)胞膜,細(xì)菌形態(tài)完整,細(xì)菌內(nèi)DNA沒有溢出。脫脂及富集細(xì)菌14000×g離心5min,微量進樣器小心移去脂肪層和上清,沉淀物即為細(xì)菌。細(xì)菌懸液的制備向EP管中加190μL的0.1mol/LPBS(pH=7.2),使沉淀的細(xì)菌重新懸浮。1.2.2.細(xì)菌的熱處理雜質(zhì)的去除取一定量生乳用300目尼龍膜過濾,去除雜質(zhì)。蛋白質(zhì)及體細(xì)胞的處理取過濾后的生乳200μL置于EP管中,加蛋白酶K(20mg/mL)5μL、10%TritonX-1001μL,50℃消化15min。實驗用蛋白酶K水解生乳中的蛋白質(zhì);用TritonX-100裂解體細(xì)胞,TritonX-100能夠破碎體細(xì)胞的細(xì)胞膜,使其內(nèi)容物溶出,從而達(dá)到裂解體細(xì)胞的作用。細(xì)菌的熱處理再向EP管中加800μL0.1mol/LPBS;100℃沸水浴10min。對細(xì)菌進行熱處理,增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,破損細(xì)菌細(xì)胞膜,細(xì)菌形態(tài)完整,細(xì)菌內(nèi)DNA沒有溢出。脫脂及富集細(xì)菌14000×g離心5min,微量進樣器小心移去脂肪層和上清,沉淀物即細(xì)菌。細(xì)菌懸液的制備向EP管中加190μL的0.1mol/LPBS(pH=7.2),使沉淀的細(xì)菌重新懸浮。1.2.3檢測波長和波長實驗采用PI進行菌體染色,PI能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA嵌合,對核酸并無特異性選擇。其激發(fā)波長488mn,發(fā)射波長620mn。它可以標(biāo)記所有的細(xì)菌,但是PI不能穿透活細(xì)菌的細(xì)胞膜,它只能在細(xì)菌細(xì)胞膜破損的情況下進入細(xì)菌內(nèi)。實驗采用100℃加熱10min對細(xì)菌進行熱處理,破壞其細(xì)胞膜,使PI染料能夠順利進入細(xì)菌內(nèi)染色DNA。染色方法:取PI染液(20μg/mL)10μL,加入到經(jīng)過前處理的樣品中,避光染色5min。1.2.4檢測結(jié)果和討論流式細(xì)胞儀的分析原理:制備好的單細(xì)胞懸液通過樣本管被壓進噴嘴的中央,同時無細(xì)胞的鞘液也被壓入噴嘴,形成包繞細(xì)胞的鞘液流,使細(xì)胞以單列進入流動室,與水平方向的激光光束(為488nm的氬離子激光)垂直相交。穩(wěn)定的液流推進裝置使樣本呈單列,每個細(xì)胞以均等的時間依次通過激光照射區(qū),被熒光染色的細(xì)胞受照射后,產(chǎn)生兩種信號,一種是散射光信號,又分為前向散射光(Forwardscatter,FSC),一般與細(xì)胞體積的大小呈正比;側(cè)向散射光(Sidescatter,SSC),與細(xì)胞的顆粒度和復(fù)雜性有關(guān)。另一種為熒光信號,發(fā)射的熒光與結(jié)合位點呈正比。不同類型的光信號被相應(yīng)的光學(xué)檢測器接收。光學(xué)信號經(jīng)電學(xué)系統(tǒng)采集,轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼W(xué)信號,經(jīng)專業(yè)軟件處理,得出檢測結(jié)果。本實驗中將經(jīng)過前處理、染色的樣品200μL移入流式管中,0.1mol/LPBS適當(dāng)稀釋。利用EXPO32ADC操作系統(tǒng)進行分析,檢測時間為60s。表1為流式細(xì)胞儀進行分析的參數(shù)設(shè)置。1.2.5平床消毒實驗對樣品進行微生物檢測的對照方法采用中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)菌落總數(shù)測定,GB4789.2-2003。1.2.6統(tǒng)計分析使用SAS6.12軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。2結(jié)果與討論2.1uht乳的染色及流式分析實驗將E.coli和S.aureus分別代表可能污染生乳的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。將E.coli或S.aureus的PBS菌懸液100℃沸水浴10min,PI染色后進行流式分析。結(jié)果如圖1A和圖1B所示,圖中分別顯示出了菌群E.coli和S.aureus在直方圖中的位置。對于熒光特性和顆粒度性質(zhì)相同的物質(zhì),它們在流式圖譜中所處的位置是相對不變的。被熒光PI染色的細(xì)菌,它在熒光通道FL3內(nèi)的強度應(yīng)大于100,說明熒光強度呈陽性反映。而體現(xiàn)細(xì)菌顆粒度的參數(shù)SS也應(yīng)處于相對固定的范圍內(nèi)。將含E.coli的UHT乳只進行100℃沸水浴10min的熱處理,PI染色后流式分析的結(jié)果如圖1C。在圖1C中可以看出E.coli沒有出現(xiàn)在指定位置,顆粒度偏大,而熒光信號也處于100以內(nèi)的陰性區(qū)間。這可能是由于脂肪球和蛋白質(zhì)顆粒的存在能夠?qū)е聼晒馊玖系姆翘禺愋匀旧?同時也影響細(xì)菌的染色。把含有E.coli的UHT乳進行脫脂處理,蛋白質(zhì)顆粒同樣會對結(jié)果產(chǎn)生不良影響(圖1D)。將含有E.coli或S.aureus的UHT乳進行完整前處理,PI染色后進行流式分析,結(jié)果如圖1E和圖1F所示,細(xì)菌群在直方圖中又出現(xiàn)在了正確的位置,E.coli和S.aureus的熒光信號均大于100,呈陽性反映,顆粒度也處在合理的范圍內(nèi)。這說明前處理方案成功的排除了乳中大顆粒物質(zhì)對流式細(xì)胞儀分析所帶來的干擾,使細(xì)菌能夠正常被染色、分析。對于UHT乳樣品實驗采用酶底比5%的胰蛋白酶處理,而處理生乳采用終濃度為0.5mg/mL的蛋白酶K處理。這是由于經(jīng)超高溫處理的生乳會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,破壞了蛋白質(zhì)顆粒的結(jié)構(gòu),使胰酶可以比較容易的裂解蛋白。而胰蛋白酶在短時間內(nèi)對生乳中蛋白質(zhì)顆粒起不到很好的消化效果。蛋白酶K性能優(yōu)越,在15min內(nèi)可以很好的消化生乳中未變性蛋白質(zhì)顆粒。2.2uht乳前處理將含有S.aureus的UHT乳樣品進行不完整的UHT乳前處理(不進行細(xì)菌熱處理),另取含有S.aureus的UHT乳樣品進行UHT乳前處理,結(jié)果分別為圖2A和圖2B。如圖所示,對于未進行熱處理的S.aureus樣品,PI無法對細(xì)菌染色,細(xì)菌的熒光信號全部處于陰性區(qū)間;而經(jīng)過熱處理的樣品,PI能穿過破損的細(xì)胞膜染色DNA,在熒光通道FL3內(nèi)幾乎所有菌體的熒光信號均顯示為陽性。2.3流式細(xì)胞術(shù)和平餅菌落計數(shù)法檢測結(jié)果將E.coli和S.aureus于營養(yǎng)肉湯中過夜培養(yǎng),分別以103~108/mL的接種量添加到UHT乳中。分別用流式細(xì)胞術(shù)、平皿菌落計數(shù)法對各梯度樣品進行檢測(圖3)。對兩種微生物的檢測結(jié)果來看,濃度范圍在104~108/mL內(nèi),流式細(xì)胞術(shù)與平皿菌落計數(shù)法的檢測結(jié)果呈正的直線相關(guān)(P<0.01),相關(guān)程度為顯著相關(guān)(rE.coli=0.9948,rS.aureus=0.9955)。對于細(xì)菌濃度為103/mL的樣品,檢測結(jié)果有較大偏差。2.4檢測上限的確定流式細(xì)胞術(shù)的最低檢出限為104/mL。由于EPICSXL型流式細(xì)胞儀每秒鐘最大的檢測值為4000個/s,因此理論上樣品濃度的檢測上限是2.4×107/mL。對于檢測結(jié)果為2.4×107/mL的樣品,需要再將樣品按級稀釋,取檢測結(jié)果在2.4×107/mL以內(nèi)的稀釋度為準(zhǔn),再進行換算。2.5生乳前處理方法將生乳樣品按生乳前處理方法進行處理,PI染色后得到流式圖譜4A。圖中黑色框選區(qū)域內(nèi)表示的是細(xì)菌。與處理含有E.coli或S.aureus的UHT乳樣品不同,經(jīng)過處理的生乳樣品中仍含有較多的非菌體微粒,它們可能是由體細(xì)胞碎片、少數(shù)未分解的蛋白質(zhì)顆粒組成。體細(xì)胞中含有DNA,可以被PI染色而顯示出熒光特性,造成假陽性結(jié)果。TritonX-100的作用就是破碎體細(xì)胞,使體細(xì)胞的DNA溢出。由于體細(xì)胞DNA的顆粒度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于細(xì)菌的顆粒度,這導(dǎo)致在直方圖上體細(xì)胞DNA的光信號不會與細(xì)菌的光信號出現(xiàn)在同一區(qū)域內(nèi),從而排除了體細(xì)胞的干擾。通過生乳前處理方法處理生乳樣品得到的結(jié)果表示的是乳液中所有菌體的數(shù)量,包括具有生命活力的細(xì)菌和已經(jīng)死亡的細(xì)菌。死亡細(xì)菌的區(qū)分方法如下:將生乳樣品進行不完整的生乳前處理(不進行細(xì)菌的熱處理)。這樣處理的生乳樣品,既去除了蛋白質(zhì)顆粒、脂肪球、體細(xì)胞的干擾,又保持了細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。由于死亡菌體溶脹,細(xì)菌細(xì)胞膜破裂,PI分子得以進入細(xì)胞內(nèi)染色DNA,其熒光特性為陽性;而活細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,PI分子不能染色,其熒光特性為陰性(圖4B)。由圖4B顯示,該樣品中死亡細(xì)菌的百分率為4.2%。從細(xì)菌總數(shù)中除去死亡細(xì)菌百分率,即為活菌數(shù)。將生乳樣品(n=10)分別用流式細(xì)胞術(shù)、平皿菌落計數(shù)法檢測細(xì)菌數(shù);再將同一個生乳樣品稀釋102倍,分別用流式細(xì)胞術(shù)、平皿菌落計數(shù)法檢測細(xì)菌數(shù)。由圖5可以看出,流式細(xì)胞術(shù)與平皿菌落計數(shù)法檢測生乳中的細(xì)菌總數(shù)的結(jié)果呈正的直線相關(guān)(P<0.01),