大鼠熱結(jié)腸道型氣分證模型的建立

大鼠熱結(jié)腸道型氣分證模型的建立

近年來，動(dòng)物育種和水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)生了許多發(fā)熱疾病，給動(dòng)物育種和水產(chǎn)帶來了巨大的損失。中獸醫(yī)學(xué)認(rèn)為,凡屬發(fā)熱性疾病均可應(yīng)用清代醫(yī)家葉天士創(chuàng)立的衛(wèi)氣營血理論進(jìn)行辨證論治。其中,熱結(jié)腸道型氣分證是溫病發(fā)展過程中的重要階段之一,發(fā)病動(dòng)物臨床以發(fā)熱,腸燥便干,糞結(jié)不通,尿短赤,口津干燥,口色深紅,舌苔黃厚,脈沉實(shí)有力為主要特征。目前尚無成熟的熱結(jié)腸道型氣分證動(dòng)物造模方法,給研究發(fā)熱性疾病機(jī)制及中藥研發(fā)帶來了巨大困難。作者擬通過給大鼠灌服熱性中藥、自身糞便及腹腔注射滅活大腸桿菌菌液,研究大鼠的臨床癥狀變化及各腸段IEL和杯狀細(xì)胞數(shù)量變化,探討大鼠熱結(jié)腸道型氣分證動(dòng)物模型的構(gòu)建條件。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料清潔級(jí)雌性SD大鼠(200~220g),共25只,購自重慶市中醫(yī)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所。于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為對照組、模型組(按時(shí)間又分1h組、3h組、5h組、7h組),共5組,每組5只。1.2濃縮成生藥濃度中藥:附子、干姜、肉桂(購自重慶市北碚區(qū)桐君閣大藥房)以1∶1∶1的比例組方,分別經(jīng)過煎煮、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成生藥濃度為1g·mL-1的藥液,于4℃保存?zhèn)溆?。RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,GHP-9080型隔水式培養(yǎng)箱,Canon數(shù)碼相機(jī),FA1004型電子天平,SW-CF-2FD型潔凈工作臺(tái),LEICA切片機(jī)、水浴鍋。1.3大鼠腸道混懸液的制備對照組和模型組大鼠均于22~25℃條件下飼養(yǎng),每日給予足量的鼠糧和潔凈飲用水。每天用附子、干姜、肉桂濃縮液,按體重以20g·kg-1的劑量給模型組大鼠灌胃,2次·d-1,對照組按相同方法灌服生理鹽水,連續(xù)12d后禁食(不禁水)12h,給予模型組大鼠灌服100g·L-1的大鼠自身糞便混懸液2mL·只-1,2次·d-1,連續(xù)2d,對照組灌服等量生理鹽水;然后分別給予對照組和模型組大鼠腹腔注射0.2mL的1011個(gè)·mL-1大腸桿菌滅活菌液和生理鹽水,分別于1、3、5和7h觀測各組大鼠臨床指標(biāo)變化,并經(jīng)0.4%戊巴比妥鈉液腹腔注射麻醉后,采集十二指腸、空腸、回腸于4%中性甲醛液中固定24h后,制作石蠟切片,并進(jìn)行HE染色。1.4服刑人員的尿形態(tài)及體重變化灌服中藥期間及注射滅活菌液后各組大鼠精神狀態(tài)、舌苔、體溫、飲水量、采食量、糞便形態(tài)及體重變化;觀察十二指腸、空腸及回腸腸道組織結(jié)構(gòu)變化,并取每只大鼠各腸段不相鄰的5張切片,計(jì)數(shù)每張切片每100個(gè)腸黏膜柱狀上皮細(xì)胞間的淋巴細(xì)胞(IEL)和杯狀細(xì)胞(GC)的數(shù)量變化。1.5單因素方差分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-wayANOVA)。2結(jié)果2.1大鼠的口色圖1對照組大鼠精神良好,被毛整潔,口色呈淡紅色,表面濕潤,舌苔薄白(圖1A),糞便為濕潤、長橢圓形糞便(圖2),尿液淡黃色,排糞量和尿液量無明顯減少。經(jīng)過灌服中藥、糞便混懸液及注射滅活大腸桿菌后,模型組大鼠變現(xiàn)為精神萎靡、被毛雜亂無章;造模初期口色呈淡紅色,后期則逐漸變?yōu)樯罴t色,且表面干燥(圖1B、C、D、E),以注射滅活大腸桿菌后5h最為明顯(圖1D),排出顆粒狀或串珠狀干結(jié)糞便(圖2),排糞量和排尿量明顯減少,尿液顏色發(fā)黃。由圖1可知,對照組(圖1A)大鼠的口色淡紅,舌苔薄白,舌津正常;模型組大鼠在注射滅活大腸桿菌液后舌色由淡紅色逐漸變?yōu)樯罴t色,舌津逐漸變少(圖1B、C),于5、7h(圖2D、E)表現(xiàn)為舌津干燥,口色干紅,舌苔淡黃。2.2大鼠食性變化由圖3可知,造模期間,模型組平均大鼠飲水量高于對照組,且模型組大鼠平均飲水量呈不斷升高趨勢。造模期間,對照組大鼠采食量前期均有所下降,后期則緩慢上升;模型組大鼠采食量于試驗(yàn)開始前2d內(nèi)略有上升,此后呈下降趨勢。由表1可知,在第13天時(shí),模型組大鼠體溫顯著高于對照組(P<0.05),其余時(shí)間與對照組無顯著差異(P>0.05)。由表2可知,在試驗(yàn)前4d內(nèi),模型組大鼠體重逐步升高,此后則不斷下降,全程均與對照組無顯著差異(P>0.05)。2.3腸道組織病理表現(xiàn)由圖4可知,與對照組大鼠腸道組織(圖4A、B、C)相比,注射滅活大腸桿菌1h后,十二指腸、空腸、回腸無顯著病理變化(圖4D、E、F);由圖4G、H、I可知,從3h開始,模型組十二指腸、空腸、回腸等腸段有輕微損傷表現(xiàn),如十二指腸、空腸和回腸腸道黏膜出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤等病理表現(xiàn)。由圖4J、K、L可知,在5h時(shí),大鼠十二指腸、空腸及回腸均出現(xiàn)了顯著病理損傷,如十二指腸有顯著的炎性細(xì)胞浸潤,且固有層與上皮層出現(xiàn)空泡化,空腸和回腸均出現(xiàn)了黏膜脫落、炎性細(xì)胞浸潤等病理損傷;同時(shí),由圖4M、N、O可知,7h組大鼠各段腸道組織病理損傷繼續(xù)加重。由此可知,模型組從5h起,十二指腸、空腸、回腸均出現(xiàn)了顯著病理變化,其中以空腸組織損傷最為明顯。2.4各組大鼠腸道組織gc、mds-gc的比較由表3可知,對照組大鼠注射生理鹽水前后體溫?zé)o顯著變化(P>0.05)。在注射滅活大腸桿菌前后,所有模型組大鼠體溫均顯著高于對應(yīng)對照組(P<0.05),且注射后模型組大鼠體溫隨著時(shí)間推移,體溫逐步升高,5h和7h時(shí)體溫顯著高于對應(yīng)未注射滅活大腸桿菌組(P<0.05),且以5h時(shí)體溫升幅最大。由表4可知,模型組大鼠十二指腸、空腸和回腸IEL數(shù)量變化趨勢基本一致。即在3、5和7h時(shí),十二指腸IEL數(shù)量均顯著高于對照組和1h組(P<0.05),且3組之間無顯著差異(P>0.05);在5h時(shí),空腸IEL數(shù)量顯著低于1和7h組(P<0.05),與對照組無顯著差異(P>0.05);5h時(shí),回腸IEL數(shù)量顯著低于1和3h組(P<0.05),且顯著高于對照組和7h組(P<0.05)。由表4可知,模型組大鼠十二指腸、空腸和回腸段GC數(shù)量變化趨勢基本一致,在3和5h時(shí),十二指腸GC數(shù)量均顯著高于對照組(P<0.05);空腸GC數(shù)量在5h時(shí)顯著低于對照組、3和7h組(P<0.05);回腸GC數(shù)量分別在5和7h時(shí)顯著低于對照組、1和3h組(P<0.05)。3盛傷津、陽熱昌盛、熱結(jié)腸道型氣分證熱結(jié)腸道型氣分證是溫?zé)岵⌒敖?jīng)衛(wèi)分傳入或直入胃腸,燥熱熾盛,與腸內(nèi)糟粕相結(jié),腑氣不同,出現(xiàn)熱盛傷津,以正盛邪實(shí),正邪相搏激烈,陽熱亢盛為特點(diǎn)的里熱實(shí)證,且熱結(jié)腸道型氣分證動(dòng)物表現(xiàn)神情倦怠、口色干紅、口渴喜飲、聳毛、糞便秘結(jié)、尿液短赤等癥狀。因此,本研究選擇精神狀態(tài)、體溫、體重、飲水量、采食量、糞便形態(tài)等作為模型構(gòu)建的監(jiān)測指標(biāo),可以全面、科學(xué)地驗(yàn)證和評價(jià)模型構(gòu)建的成功與否。3.1大鼠飲水量和食性變化本研究表明,模型組大鼠初期呈現(xiàn)活動(dòng)增加、躁動(dòng)不安等,后期呈現(xiàn)精神萎靡、豎毛、蜷縮成堆、活動(dòng)減少等現(xiàn)象,于注射滅活大腸桿菌液后5h時(shí)表現(xiàn)最為明顯;模型組大鼠飲水量顯著高于對照組(P<0.05),且呈逐漸升高的趨勢,體現(xiàn)大鼠口渴喜飲的癥狀,模型組大鼠采食量呈下降趨勢,糞便呈現(xiàn)秘結(jié)。因此,綜合造模后大鼠的精神狀態(tài)、口色變化、體溫、采食量、飲水量、體重、糞便等指標(biāo)的變化,確定成功建立大鼠熱結(jié)腸道型氣分證模型,且以注射滅活大腸桿菌菌液后5h時(shí)臨床癥狀最符合熱結(jié)腸道型氣分證動(dòng)物模型特點(diǎn)。3.2腸道屏障作用腸道黏膜免疫系統(tǒng)是腸道屏障的重要組成部分,與腸道上皮細(xì)胞一起保護(hù)腸道,使其免受細(xì)菌、病毒等微生物的入侵,防止異物的黏附和吸收,起到機(jī)體第一道防線的作用。腸道屏障作用主要由IEL和GC等免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子共同完成。小腸絨毛上的GC是分泌細(xì)胞,分泌含有糖蛋白的黏液,可黏附在小腸黏膜表面,具有保護(hù)屏障作用,可保護(hù)上皮表面不受細(xì)菌、病毒以及水解酶的侵害,即GC可能在腸黏膜損傷后的重建過程中起關(guān)鍵作用。本研究表明,從注射滅活大腸桿菌液后的3到5h時(shí)間段內(nèi),GC數(shù)量逐漸下降,5h時(shí)數(shù)量最少,且以空腸段變化最明顯,即熱結(jié)腸道型氣分證大鼠腸黏膜屏障和黏膜免疫功能受到損傷,且以5h為轉(zhuǎn)折點(diǎn)。4大鼠熱結(jié)腸道型氣分證模型的建立在經(jīng)過灌服熱性中藥12d,并給予2d的自身糞便液后,再經(jīng)注射滅活大腸桿菌后5h時(shí)可出現(xiàn)典型的熱結(jié)腸道型氣分證的臨床癥狀,即可建立大鼠熱結(jié)腸道型氣分證模型;且腸道組織結(jié)構(gòu)、IEL和GC數(shù)量的變化進(jìn)一步證明,注射滅活菌液后5h時(shí)可成功制作熱結(jié)腸道型氣分證模型,可為熱結(jié)腸道型氣分證的證候研究提供試驗(yàn)依據(jù)。3.1.1熱擾心功能本研究選用溫里藥白附子、干姜、肉桂的水煎劑作為造模藥物。附子、干姜、肉桂均辛熱燥烈,入脾腎經(jīng),過量服用,易致機(jī)體陽氣過旺,則氣有余便是火,導(dǎo)致內(nèi)熱熾盛等里熱證,出現(xiàn)熱擾心神,則大鼠表現(xiàn)為心神不寧、躁動(dòng)不安等;在灌服糞便后和腹腔注射滅活大腸桿菌菌液后,由于糞便秘結(jié)及滅活大腸桿菌釋放出內(nèi)毒素,導(dǎo)致內(nèi)毒素吸收,出現(xiàn)體溫急劇升高,即內(nèi)熱熾盛,傷津耗氣,大鼠表現(xiàn)為精神萎靡,聳毛、發(fā)抖,扎堆聚集等,符合熱結(jié)腸道型氣分證特征。3.1.2模型大鼠口色的變化按中獸醫(yī)理論,氣有余便是火。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體因熱邪侵襲而里熱內(nèi)盛之時(shí),其氣必有余;氣催血?jiǎng)?口色變?yōu)轷r紅;口色鮮紅、苔黃厚為里熱證的主要癥狀之一。在本研究中,對照組口色無變化,模型組大鼠在注射大腸桿菌滅活菌液后,口色由注射后1h略帶濕潤的淡紅色,在注射3h時(shí)略帶濕潤的深紅色,再變?yōu)樽⑸浜?h較干燥的鮮紅色。結(jié)果表明,大鼠在注射大腸桿菌滅活菌液后里熱證癥狀逐步加重,并在5h時(shí)最為明顯,體現(xiàn)了熱結(jié)腸道型氣分證的動(dòng)物口色和舌苔特征。3.1.3熱結(jié)腸道型氣分證由于內(nèi)熱郁積,易傷津液,津液被內(nèi)熱消耗后,則動(dòng)物表現(xiàn)出口渴、喜飲的癥狀;同時(shí)熱結(jié)腸道型氣分證是正邪相爭、陽盛邪實(shí)的里熱證,火熱之邪亢盛,里熱蒸騰,故見高熱;且熱邪侵襲胃腸,燥熱之邪若與胃腸中糟粕相結(jié)則造成便干或糞結(jié)之癥,引起胃腸功能紊亂,導(dǎo)致飲食不良、營養(yǎng)缺乏等不良后果,表現(xiàn)為糞便由長橢圓性、略帶濕潤的糞粒變?yōu)楦山Y(jié)的串珠狀,同時(shí)采食量和體重均出現(xiàn)下降。研究表明,病邪在氣分者,機(jī)體主要體現(xiàn)為功能性損傷,在營分和血分則會(huì)對器官造成實(shí)質(zhì)性損傷。因此,熱結(jié)腸道型氣分證是消化系統(tǒng)分泌功能紊亂,消化腺分泌功能減弱,胃腸蠕動(dòng)減少,食糜在胃腸中停滯而發(fā)酵,大便秘結(jié),胃腸菌群比例失調(diào),細(xì)菌大量繁殖并產(chǎn)生大量內(nèi)毒素,引起胃腸道、肝臟損傷等全身性中毒反應(yīng)的綜合癥狀,腸道中內(nèi)毒素的增多,會(huì)進(jìn)一步加重腸道黏膜損傷,引起胃腸內(nèi)細(xì)菌移位,抑制胃腸蠕動(dòng),從而又加重便秘。因此,造模期間飲水量、采食量和體重的變化符合中獸醫(yī)熱結(jié)腸道型氣分證的辨證特征。3.1.4內(nèi)毒素對大鼠體溫的影響本研究表明,在注射滅活大腸桿菌前,模型組大鼠體溫均出現(xiàn)明顯升高,注射滅活大腸桿菌后大鼠體溫均出現(xiàn)顯著升高,且以5h時(shí)體溫升高值最高。從體溫角度來看,模型組大鼠在注射滅活大腸桿菌5h時(shí)體溫升高最為明顯。研究表明,大腸桿菌滅活后可釋放出內(nèi)毒素,由于內(nèi)毒素具有很強(qiáng)的熱原性,注入微量內(nèi)毒素即可使體內(nèi)粒細(xì)胞大量釋放內(nèi)源性致熱原,刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞而引起發(fā)熱[8-10]。因此,造模后以5h時(shí)體溫最符合氣分證動(dòng)物臨床特征。3.2.1大鼠臨床癥狀最符合熱結(jié)腸道型氣分證特征從腸道組織結(jié)構(gòu)變化來看,在注射滅活大腸桿菌后5h,腸道組織結(jié)構(gòu)損傷最為明顯,且以空腸損傷為主,進(jìn)一步說明5h時(shí)大鼠臨床癥狀最符合熱結(jié)腸道型氣分證特征。研究表明,在熱結(jié)腸道型氣分證狀態(tài)下,由于腸道屏障功能損傷,致使出現(xiàn)腸源性內(nèi)毒素血癥和腸道細(xì)菌移位,此二者作為誘發(fā)因子導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)失控,進(jìn)而表達(dá)、產(chǎn)生和釋放大量炎癥介質(zhì),造成腸道組織結(jié)構(gòu)損傷和功能破壞。3.2.2自身皮內(nèi)黏磺酸iel的數(shù)量IEL是機(jī)體免疫系統(tǒng)中與外來抗原最先接觸的免疫細(xì)胞,同時(shí)也是最先發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞,故IEL是腸道相關(guān)淋巴組織中的特殊組分,其數(shù)量多少與腸道吞噬抗原能力和殺滅病原微生物的效果有