綠球藻choroccumspmc-1株系高鹽堿培養(yǎng)適應(yīng)性及蝦青素積累特性的初步研究

綠球藻choroccumspmc-1株系高鹽堿培養(yǎng)適應(yīng)性及蝦青素積累特性的初步研究

蝦青素屬于氨基酸丙烯酸酯。它是許多水生動(dòng)物所需的營(yíng)養(yǎng)成分和優(yōu)良的顏色組合。它具有抗紫外輻射、抗癌、腫瘤等功能。蝦青素抗氧化功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它次生類胡蘿卜素、維生素E和維生素C,因而倍受食品、制藥和化妝品工業(yè)的青睞。近年來(lái),從微藻中開(kāi)發(fā)高值化的天然蝦青素在國(guó)際上引起了廣泛的關(guān)注。雨生紅球藻Haematococcuspluvialis在脅迫條件下可以大量積累蝦青素,含量高達(dá)細(xì)胞干重的4%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它生物。由于雨生紅球藻生長(zhǎng)速度慢,易受微生物污染,在培養(yǎng)過(guò)程中難以獲得高產(chǎn),使其產(chǎn)品成本高昂,嚴(yán)重妨礙了產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)與推廣。由此尋找可快速生長(zhǎng)、積累蝦青素的綠藻如小球藻Chlorellazofingiensis、綠球藻Chlorococcumsp.等綠藻作為替代種源受到廣泛重視。迄今為止,在世界上數(shù)萬(wàn)種微藻資源中,產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)最為成功的僅有螺旋藻、小球藻和鹽藻,藻種對(duì)高堿和(或)高鹽的極端適應(yīng)和快速生長(zhǎng)特性對(duì)其產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)起到關(guān)鍵作用。篩選極端適應(yīng)和快速生長(zhǎng)的微藻,建立低成本開(kāi)放式養(yǎng)殖,提高細(xì)胞生物活性成分的含量,研究極端條件下生物活性物質(zhì)的誘導(dǎo)與轉(zhuǎn)化機(jī)制具有重要的理論與實(shí)踐意義。本研究對(duì)分離篩選到的耐堿性綠球藻開(kāi)展生長(zhǎng)特性、極端適應(yīng)特性和蝦青素誘導(dǎo)等方面進(jìn)行的初步研究,探索合理開(kāi)發(fā)天然蝦青素的新方法與新思路,為其產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)與深入研究打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1藻類和繁殖方法1.1.1微藻體系的分離與純化本研究材料綠球藻株系MC-1(簡(jiǎn)稱MC-1)由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所微藻項(xiàng)目組于2002年在室外藍(lán)藻培養(yǎng)箱中分離得到,后經(jīng)固體純化培養(yǎng)得到株系。1.1.2檸檬酸和土壤提取液使用ZSNT培養(yǎng)基,配制方法為每升蒸餾水中分別加入1gNaCl、0.05gNaH2PO4·2H2O、1gNaNO3、0.02gCaCl2、0.05gMgSO4·7H2O、0.01g檸檬酸以及M2、A5和土壤提取液各1ml,其中每升M2水溶液含有0.244gFeCl3·6H2O和0.189gNa2EDTA,每升A5水溶液含有2.86gH3BO3、0.22gZnSO4·7H2O、0.01gMOO3、1.80gMnCl2·4H2O和0.08gCuSO4·5H2O。ZSNT培養(yǎng)基pH為7.91,高壓滅菌后根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要添加不同量的NaHCO3。1.1.3體外強(qiáng)光誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)紅耐堿性實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行,培養(yǎng)架光強(qiáng)為135μE·m-2·s-1,溫度為28±2℃,光周期L∶D為24∶0。室外強(qiáng)光誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)紅:將室內(nèi)培養(yǎng)綠色細(xì)胞分2組轉(zhuǎn)移到室外培養(yǎng),其中1組維持室內(nèi)培養(yǎng)時(shí)的營(yíng)養(yǎng)鹽條件,NaCl和NaHCO3濃度同為1g·L-1,另一組采用高鹽高堿誘導(dǎo),通過(guò)逐步加入NaCl和NaHCO3,使其終濃度分別為51g·L-1和81g·L-1,總鹽度大于130,太陽(yáng)直射光最大光強(qiáng)約1400μE·m-2·s-1。1.1.4mc-1生長(zhǎng)曲線的繪制MC-1生長(zhǎng)測(cè)定用Unicon-UV-2102紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)700nm光密度值作為生物量指標(biāo),繪制MC-1的生長(zhǎng)曲線并計(jì)算比生長(zhǎng)率。1.2hplc分析HPLC方法參考Yuan等的方法進(jìn)行,藻細(xì)胞經(jīng)離心收集,棄上清液,用蒸餾水清洗,然后冷凍干燥。定量取冷凍干燥樣品10—15mg,在避光條件下加液氮研磨,丙酮反復(fù)提取直至樣品變白為止。提取液低溫高速離心(4℃,12000r·min-1離心20min)去沉淀,上清液用氮?dú)獯蹈?用甲醇/二氯甲烷(9.5∶3)定容為1.25ml,然后進(jìn)行HPLC分析。儀器采用美國(guó)Waters1525型高效液相色譜儀,Waters2996型檢測(cè)器,Waters反相色譜柱SymmetryShieldTMRP185μm(3.9mm×150mm)。HPLC流動(dòng)相A液:二氯甲烷/甲醇/乙腈/水為10∶170∶11∶9;B液:二氯甲烷/甲醇/乙腈/水為44∶56∶91∶9。用100%的A液梯度洗脫0—8min;用0到100%的B液梯度洗脫8—15min;用0到100%的A液梯度洗脫15—16min;用100%的A液梯度洗脫16—25min。流速為1.0ml·min-1,進(jìn)樣體積20μl。2996型檢測(cè)器在250—700nm波長(zhǎng)范圍掃描,在450nm處進(jìn)行檢測(cè)。用蝦青素、葉黃素、角黃素、葉綠素b、葉綠素a和β-胡蘿卜素(Sigma產(chǎn)品)做標(biāo)準(zhǔn)品。類胡蘿卜素含量測(cè)定參考Dere等的方法進(jìn)行。1.3t檢驗(yàn)的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行樣,取其平均值。統(tǒng)計(jì)用Excel將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn),以p<0.05作為顯著依據(jù)。圖1、2中所示值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。2結(jié)果2.1比生長(zhǎng)率及比生長(zhǎng)率在較低碳酸氫鈉濃度范圍內(nèi),MC-1具有良好的快速生長(zhǎng)特性,其中碳酸氫鈉濃度為0.8g·L-1時(shí),最大比生長(zhǎng)率達(dá)到每天1.18,分裂代時(shí)為14h,持續(xù)培養(yǎng)1周,平均比生長(zhǎng)率最高每天可達(dá)0.49,平均分裂代時(shí)為34h(圖1)。碳酸氫鈉在較低濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加促進(jìn)MC-1生長(zhǎng)作用越明顯,完全不加碳酸氫鈉組的生長(zhǎng)率低于不同濃度的添加組(圖1,2)。2.2生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)mc-1的影響圖2顯示MC-1在高堿條件下的快速生長(zhǎng)特性,在含有8—20g·L-1碳酸氫鈉的高堿培養(yǎng)基中,MC-1生長(zhǎng)狀態(tài)良好,無(wú)論是最大生長(zhǎng)率還是平均生長(zhǎng)率均保持較高的水平。經(jīng)測(cè)定,在3—4d內(nèi)的進(jìn)一步培養(yǎng)中,MC-1培養(yǎng)物的pH從8左右迅速升到12以上,并繼續(xù)生長(zhǎng),表現(xiàn)出非同尋常的極端堿性適應(yīng)特性。2.3紅色細(xì)胞色素組分的hplc分析室內(nèi)培養(yǎng),處于靜止生長(zhǎng)的老化培養(yǎng)物,藻細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)紅,而經(jīng)室外強(qiáng)光照射,指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的藻細(xì)胞也迅速轉(zhuǎn)紅(轉(zhuǎn)紅周期見(jiàn)表2)。圖3、4為綠色和紅色細(xì)胞色素組分的HPLC分析結(jié)果,并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣、保留時(shí)間和特征吸收峰以及參考文獻(xiàn)鑒別色素組分(表1)。HPLC結(jié)果表明,綠色細(xì)胞轉(zhuǎn)為紅色細(xì)胞后,其光合色素組分發(fā)生改變,出現(xiàn)了蝦青素、蝦青素酯、金盞花黃質(zhì)以及金盞花黃質(zhì)酯4個(gè)新組分。由圖4各組分的光吸收強(qiáng)度可以推斷,這4種次生類胡蘿卜素組分占總色素含量的比例較大。同時(shí),室內(nèi)緩慢和室外快速2種狀態(tài)的轉(zhuǎn)紅細(xì)胞,其光合色素組分基本一致。2.4蝦青素快速積累MC-1在室外強(qiáng)光低鹽低堿和強(qiáng)光高鹽高堿誘導(dǎo)下,細(xì)胞可分別在6、10d(其中有2個(gè)陰天)的短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)紅,并快速積累蝦青素(表2)。室內(nèi)培養(yǎng)MC-1轉(zhuǎn)紅細(xì)胞,蝦青素含量是0.61mg·g-1,總類胡蘿卜素含量是1.25mg·g-1,強(qiáng)光誘導(dǎo)后蝦青素和總類胡蘿卜素含量稍有提高,強(qiáng)光高鹽高堿誘導(dǎo)后兩者含量顯著提高(p<0.05),分別提高50.46%和71.20%,含量達(dá)到0.93mg·g-1和2.14mg·g-1。3討論3.1ph對(duì)微藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MC-1具有良好的極端堿性、滲透脅迫(高鹽)適應(yīng)特性。堿性的大幅度變動(dòng)對(duì)MC-1的生長(zhǎng)影響不明顯(圖2),最大適應(yīng)生長(zhǎng)pH大于12,并可以忍耐130以上的高鹽度,并能使細(xì)胞快速轉(zhuǎn)紅。這種生理特性在微藻中十分罕見(jiàn)。利用這一特性,可望建立如同鹽藻和螺旋藻模式的開(kāi)放培養(yǎng)系統(tǒng),通過(guò)碳酸氫鈉濃度和鹽度來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)物狀態(tài),避免其它生物污染,實(shí)現(xiàn)低成本的大規(guī)模培養(yǎng)。3.2mc-1核心呈味生物,其缺失代謝,其細(xì)胞毒性影響尋找快速生長(zhǎng)、極端適應(yīng)和積累蝦青素的藻類來(lái)取代雨生紅球藻的研究引起了科研工作者的廣泛重視。Ip報(bào)道了快速生長(zhǎng)的小球藻可以混合培養(yǎng)并可積累大量的蝦青素。Zhang等報(bào)道了一種快速生長(zhǎng)、適應(yīng)高pH、強(qiáng)光誘導(dǎo)產(chǎn)生大量蝦青素的綠球藻,其可適應(yīng)的最大pH只在10.0以下,pH高于10.0的培養(yǎng)條件將導(dǎo)致細(xì)胞很快死亡。但本實(shí)驗(yàn)中MC-1在室外高鹽高堿條件下可高效積累蝦青素等次生類胡蘿卜素,其轉(zhuǎn)化速度明顯快于已報(bào)道的其它綠藻,并能維持高比例的游離蝦青素(占總類胡蘿卜素的43%),顯示出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值與理論研究意義。MC-1次生類胡蘿卜素代謝特別是蝦青素的誘導(dǎo)合成過(guò)程較為特殊,其它綠藻出現(xiàn)多種蝦青素中間代謝產(chǎn)物,如海膽酮、3-羥基海膽酮、β-隱黃質(zhì)、Adonirubin、金盞花黃質(zhì)等,而MC