超聲波提取活性污泥中微生物dna及其應(yīng)用

超聲波提取活性污泥中微生物dna及其應(yīng)用

彈性梯度預(yù)收液（dgge）技術(shù)是目前最有效的微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)工具之一。在使用dgge分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)，應(yīng)優(yōu)化其所有聯(lián)系。其中，能否正確有效地提取廢水，是評(píng)價(jià)隨后實(shí)驗(yàn)成功的重要因素之一。目前，用于提取dna的方法通常采用液氮冷凍法、酶法和玻璃研磨法。在這些方法中，很難提取活性污泥，而且它們的再現(xiàn)性很差。此外，生態(tài)廢液的組成是復(fù)雜的，并且含有大量化學(xué)成分，因此提取的廢水土壤很難擴(kuò)散到pcr。因此，有效的修復(fù)方法非常重要。在超聲波破傷細(xì)胞中提取微生物dna具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)。薛俊龍等人發(fā)現(xiàn)，超聲法可以很容易地提取浙江省的dna。為了獲得能夠更好地提取活性廢液dna的問題，超聲提取dna并進(jìn)行pcr擴(kuò)增試驗(yàn)。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行dgge分析。事實(shí)證明，超聲分離法可以更好地提取活性廢液。1材料和方法1.1廢水干污泥的樣品取至生物制氫連續(xù)流攪拌槽式反應(yīng)器.1.2從活性污污泥中提取納米顆粒1樣品的預(yù)處理取1~2mL活性污泥加入5mL離心管中,用無菌純水混勻振蕩污泥,8000r/min離心5min,倒掉上清液,如此反復(fù)3次,樣品均調(diào)整到濕重0.2g.2超聲時(shí)間的影響污泥中加入200μL的TE液(250mmol/LTris-HCl(pH8.0)、50mmol/LEDTA、20%蔗糖溶液)后混勻,靜置1min后,用超聲儀(VCX130PB,Sonic)破碎細(xì)胞.為了分析超聲時(shí)間對(duì)DNA提取的影響,在超聲功率為50Hz的條件下,分別設(shè)置超聲時(shí)間為9s,18s,27s,36s,45s;全部超聲在冰浴上進(jìn)行.超聲后樣品在4℃下12000r/min離心3min,吸取上清液至另一1.5mL離心管中.3醇沉加入2倍體積的無水乙醇,混勻后-20℃醇沉2h.12000r/min離心5min,然后吸掉上清液.加入60μL的TE液,然后置于-20℃中保存.1.3dna純度的測(cè)定用紫外分光光度儀(BeckmanDU800)測(cè)定DNA粗提液的濃度.將2μLDNA提取液用TE液稀釋至100μL,重復(fù)5次取其平均值.根據(jù)公式:[dsDNA]=50×OD260×稀釋倍數(shù),計(jì)算DNA的質(zhì)量濃度(單位為μg/mL),換算出每克濕泥提取DNA的量.可以通過測(cè)定260nm/230nm(DNA/腐植酸+RNA)和260nm/280nm(DNA/蛋白質(zhì))的比值來檢測(cè)DNA的純度.1.41pcr擴(kuò)增及產(chǎn)物的提取用16SrRNA基因V3區(qū)域通用引物對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增.上游引物為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,下游引物為5′-ATTACCGCGGCTGCTGGC-3′,擴(kuò)增片段長度為200bp的片段.25μL的PCR反應(yīng)體系組成如下:10ng模板、0.5μL正反向引物、2μLdNTPs(每種10mmol/L)、2.25μL的10×PCRbuffer(MgCl2)、0.125μL的r-Taq聚合酶(TaKaRa),用無菌純水補(bǔ)齊到25μL.PCR反應(yīng)條件:采用梯度PCR優(yōu)化策略擴(kuò)增,94℃預(yù)變性4min,94℃變性1min,55℃退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán),72℃最終延伸30min.PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).1.5pcr擴(kuò)增dppe的方法原理采用DcodeTM的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad),制備6%到12%的聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度從30%到60%(100%的變性劑為7mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺的混合物),取PCR樣品5μL和10×加樣緩沖液混合后加入上樣孔.在200V的電壓下,60℃電泳4h.電泳結(jié)束后,將凝膠進(jìn)行銀染.將染色后的凝膠用Powerlook1000(UMAX)透射掃描儀進(jìn)行掃描,獲取膠圖.然后利用Gel-ProAnalyzer(MediaCybernetics)軟件分析DGGE的指紋圖譜.2結(jié)果與討論2.1超聲時(shí)間的影響活性污泥在超聲破胞后釋放出大分子物質(zhì),通過醇沉進(jìn)一步濃縮核酸.由于沒有經(jīng)過純化步驟,從OD260/OD230值和OD260/OD280值中可以看出,提取到的DNA粗提液純度較低,含有大量的腐殖質(zhì)、RNA和蛋白質(zhì)(表1).不同超聲時(shí)間獲得的DNA純度差異較小,但每克濕泥提取到的DNA量差異較大.超聲27s時(shí)提取的DNA量最大為105.29μg/g,超聲時(shí)間大于和小于27s時(shí),提取的DNA量均降低.由此可見,用該超聲法可以有效地提取污泥DNA,但在一定的功率下(本試驗(yàn)采用50Hz),超聲時(shí)間對(duì)提取效率有很大影響.但是,活性污泥中發(fā)酵細(xì)菌含有大量的內(nèi)含物雜質(zhì),在細(xì)菌破胞時(shí)與核酸物質(zhì)一同釋放,因此,單純用超聲波法提取DNA純度一定會(huì)減低,可根據(jù)具體情況進(jìn)行進(jìn)一步純化.2.2pcr擴(kuò)增效果檢測(cè)為了檢驗(yàn)提取DNA能否通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因.以等量的污泥DNA作為模板,用16SrRNA基因V3區(qū)域通用引物對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增.PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖1所示.從圖中可看出擴(kuò)增條帶特異性較好,超聲破碎細(xì)胞提取DNA可以通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段,并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).可見,DNA粗提體中即使含有一些雜質(zhì),也沒有對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生干擾.而通常利用其他方法提DNA后,進(jìn)行粗提液的純化,也無法獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,這可能是由于在超聲過程中使其中蛋白質(zhì)發(fā)生變性,從而并沒有對(duì)PCR過程產(chǎn)生影響.對(duì)擴(kuò)增PCR條帶的亮度進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)超聲27s的樣品信號(hào)最強(qiáng),而超聲45s的條帶最弱.可見,超聲時(shí)間對(duì)細(xì)菌DNA的多樣性和擴(kuò)增效率均有一定的影響.2.3dage分析對(duì)微生物群落進(jìn)行準(zhǔn)確分析在很大程度上依賴于提取DNA的質(zhì)量、產(chǎn)量和多樣性,因此判斷一種提取DNA方法是否有效,就要看這種方法提取的DNA是否能充分反映活性污泥中的種群多樣性,是否有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn).為分析不同超聲時(shí)間對(duì)提取活性污泥DNA多樣性的影響,采用DGGE技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行了多樣性的分析.DGGE指紋圖譜的條帶越豐富說明群落多樣性越大,條帶信號(hào)越強(qiáng),表示該種DNA的細(xì)菌數(shù)量越多.因此,可以根據(jù)指紋信息確定活性污泥中所含有的微生物的數(shù)量關(guān)系,得出微生物多樣性的信息.DGGE圖譜顯示PCR產(chǎn)物得到了很好的分離,利用超聲波破碎法提取的DNA可以應(yīng)用于群落分析(圖2).5個(gè)樣品呈現(xiàn)了相似的圖譜,但是還是存在一些低豐度的差異.圖2“?”和“?”標(biāo)記的條帶為27s樣品與其他樣品的一些差異條帶.超聲時(shí)間為27s所得的樣品的條帶數(shù)量和信號(hào)明顯優(yōu)于其他的超聲時(shí)間所得的樣品條帶.這種現(xiàn)象可能是由于超聲時(shí)間太短會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破碎不充分,污泥中一些數(shù)量較少的稀有細(xì)菌沒有釋放出核酸物質(zhì),而超聲時(shí)間太長則對(duì)提取的DNA也有一定的破壞作用,導(dǎo)致無法獲得完整的PCR擴(kuò)增片段.利用Gel-ProAnalyze對(duì)圖譜進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)條帶最多的第3泳道條帶達(dá)到27條,條帶最少的第1泳道條帶也有19條之多(圖2).超聲時(shí)間為27s的樣品中種群強(qiáng)度最高能達(dá)到0.7OD(見圖3).這說明不同超聲時(shí)間提取的DNA反映的種群多樣性有明顯的差異.如果一些功能菌群在群落中是處于低豐度水平,必須對(duì)DNA的提取進(jìn)行優(yōu)化.所以,在利用超聲波破碎法提取污泥DNA后進(jìn)行DGGE群落分析時(shí),必須根據(jù)樣品種類和樣品量對(duì)超聲條件進(jìn)行優(yōu)化,以期獲得理想的效果.3超