不同干燥條件下銀杏葉化學(xué)成分的變化

不同干燥條件下銀杏葉化學(xué)成分的變化

銀杏葉是銀杏科植物的銀杏干燥葉子。它在秋天會(huì)被收集在綠色的葉子上。本品味甘、苦、澀,性平,歸心、肺經(jīng),具有斂肺,平喘,活血化瘀,止痛的功效,主用于肺虛喘咳,冠心病,心絞痛,高血脂癥的治療。近代科學(xué)研究證明,銀杏葉中含有豐富的黃酮苷、雙黃酮、銀杏內(nèi)酯等化學(xué)成分以及人體所需的營養(yǎng)元素。銀杏葉中還含有銀杏酚酸,而其中的銀杏酸是主要毒性成分,屬細(xì)胞毒素,可能與誘導(dǎo)機(jī)體突變和致癌有關(guān),能引起皮膚、黏膜等處的過敏性炎癥反應(yīng),皮膚接觸它常引起漆毒樣皮炎。產(chǎn)地加工是藥材生產(chǎn)與品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié),其間發(fā)生著從非藥用部位的去除、藥效物質(zhì)的最大保留、毒性成分的降低、化學(xué)成分間的相互轉(zhuǎn)化等物理化學(xué)變化,最終目的是生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)藥材,保障臨床用藥的有效性和安全性,如在丹參的干燥過程中,隨著溫度的升高,以丹酚酸B為代表的縮合酚酸含量不斷下降,以丹參素、原兒茶醛為代表的小分子含量不斷上升,并有新的小分子生成,這些酚酸之間存在相互轉(zhuǎn)化此消彼長的關(guān)系;當(dāng)歸在微波干燥條件下,當(dāng)歸多糖含量高于曬干、陰干、熏干等方法,且促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的效果最好。但許多中藥材采收后,各產(chǎn)地加工方法不一,干燥方法對(duì)質(zhì)量的影響還缺乏研究。本文采用UPLC-TQ-MS聯(lián)用技術(shù),對(duì)銀杏葉干燥過程中黃酮、內(nèi)酯及酚酸類共24種成分含量變化進(jìn)行了探討,為銀杏葉藥材的產(chǎn)地初加工方法提供科學(xué)依據(jù)。1藥物、試劑與儀器WatersACQUITYUPLC系統(tǒng)(包括四元泵溶劑系統(tǒng),在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器;Waters公司,Milford,USA);XevoTQ檢測(cè)器(Waters公司);MassL-ynx4.1質(zhì)譜工作站軟件(Waters公司);Pmb53型快速水分測(cè)定儀(德國Adam公司);BT125型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);DHG-9240型鼓風(fēng)干燥箱(杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠);EPED超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司);KQ-250E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);AnkeGL-16GII型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)?；瘜W(xué)對(duì)照品兒茶素(877-200001)、表兒茶素(878-200102)、槲皮素(1000861-200406)、山柰酚(110861-200304)、異鼠李素(110860-200406)、木犀草素(111520-200504)、銀杏內(nèi)酯A(110862-201009)、銀杏內(nèi)酯B(110863-200508)、銀杏內(nèi)酯C(110864-200906)、白果內(nèi)酯(110865-200605)、白果新酸(111690-200702)、槲皮素3-O-[6-O-(α-L-鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷](100080-200306)均購自中國食品藥品檢定研究院,表沒食子酸兒茶素(39825)、芹菜素(22806)、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷(43089)購自上海晶純有限公司,其余為本實(shí)驗(yàn)室從銀杏葉中分離自制,其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)1H,13C-NMR和ESI-MS分析確認(rèn),純度經(jīng)HPLC檢測(cè)均大于98%。甲酸和乙腈均為色譜純,分別購自德國Merck公司和美國Tedia公司;去離子水為經(jīng)易普易達(dá)超純水制備系統(tǒng)自制;其他化學(xué)試劑均為分析純,購自上海國藥化學(xué)試劑公司。銀杏葉樣品于2012年7月采自南京中醫(yī)藥大學(xué)校園內(nèi),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為銀杏科植物銀杏G.biloba的葉。標(biāo)本存放于江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。將剛采摘成熟度相同新鮮銀杏葉均勻分成6批,除去葉柄,經(jīng)快速水分測(cè)定儀測(cè)得其含水量為70%。分別采用曬干,陰干,35,45,60,80℃烘干3種方法進(jìn)行干燥處理,干燥過程中利用快速水分測(cè)定儀定時(shí)測(cè)定其水分,并在各條件下水分損失相當(dāng)時(shí)取樣,將樣品切成直徑約1mm的碎塊后勻漿或粉碎,存放于-80℃冰箱中備用。2測(cè)量2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱定干燥至恒重的對(duì)照品適量,加80%甲醇制成儲(chǔ)備液,再分別吸取適量制成質(zhì)量濃度分別為(-)表沒食子酸兒茶素3.2mg·L-1(1)、(+)兒茶素2.4mg·L-1(2)、(-)表兒茶素3.2mg·L-1(3)、槲皮素-3-O-[6-O-(α-L-鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷]4.96mg·L-1(4)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷3mg·L-1(5)、白果內(nèi)酯3.92mg·L-1(6)、銀杏內(nèi)酯C3.84mg·L-1(7)、槲皮素-3-O-α-L-(葡萄糖基-β-D-1,2-鼠李糖苷)5.92mg·L-1(8)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷4.16mg·L-1(9)、銀杏內(nèi)酯B4.72mg·L-1(10)、銀杏內(nèi)酯A3.32mg·L-1(11)、木犀草素3.2mg·L-1(12)、槲皮素3.76mg·L-1(13)、芹菜素3.22mg·L-1(14)、山柰酚3.44mg·L-1(15)、異鼠李素3.44mg·L-1(16)、穗花杉雙黃酮2.64mg·L-1(17)、去甲銀杏雙黃酮4.72mg·L-1(18)、芫花素3.68mg·L-1(19)、銀杏雙黃酮3.72mg·L-1(20)、異銀杏雙黃酮4.2mg·L-1(21)、金松雙黃酮3.2mg·L-1(22)、白果新酸4.16mg·L-1(23)、銀杏酸3.52mg·L-1(24)的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。取不同體積的上述儲(chǔ)備液加甲醇稀釋后,制成6份不同濃度的對(duì)照品溶液,用以線性關(guān)系考察。對(duì)照品溶液在注入液相色譜儀前經(jīng)13000r·min-1,4℃離心10min,取上清液過0.22μm的微孔濾膜濾過。所有的對(duì)照品溶液均在4℃條件下貯藏。2.2試驗(yàn)溶液的制備2.3色譜圖的建立ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱(2.1mm×100mm,1.7μm);流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~7min,10%~35%B;7~11min,35%~60%B;11~14min,60%~100%B;14~17min,100%B),優(yōu)化后的色譜圖見圖1。流速0.4mL·min-1,柱溫35℃,進(jìn)樣體積1μL。2.4脫溶劑氣流量離子化模式ESI-/ESI+;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式;毛細(xì)管電壓3.0kV;離子源溫度150℃;脫溶劑氣溫度550℃;脫溶劑氣流量1000L·h-1;錐孔氣流量50L·h-1;碰撞氣流量0.15mL·min-1;各化合物的保留時(shí)間、取樣錐孔電壓及碰撞能量見表1。3結(jié)果3.1目標(biāo)峰的鑒定通過與對(duì)照品比對(duì)保留時(shí)間及負(fù)離子模式下ESI-MS/MS信息對(duì)目標(biāo)峰進(jìn)行鑒定;利用峰面積與濃度方程計(jì)算出各個(gè)成分的含量。以不同干燥條件下水分損失量為橫坐標(biāo),成分含量為縱坐標(biāo),繪制曲線圖。3.2不同制干條件下含量(-)表沒食子酸兒茶素、(+)兒茶素、(-)表兒茶素三者在各干燥條件下含量與鮮品相比,制干后均有不同程度的降低,其中80℃烘干損失最少,曬干條件下?lián)p失最多且趨勢(shì)最明顯,見圖2,損失高達(dá)60%~90%,三者制干后含量均為80℃>60℃>45℃>35℃,陰干>曬干。3.3各原料含量的變化黃酮在銀杏葉中含量較低,見圖3,在0.24~28.44μg·g-1,其中木犀草素、槲皮素、芹菜素和異鼠李素均在曬干條件下有較明顯的上升趨勢(shì)出現(xiàn),與鮮品相比,制干后四者含量分別增加95.0%,162.5%,109.0%,13.5%,且在45,60℃烘干條件下也有利于4者成分的積累,山柰酚在鮮品中及陰干和80℃烘干條件下均未檢測(cè)到,在其他條件下隨著水分的減少含量從無到有并逐漸上升,而芫花素在制干前后含量基本一致。槲皮素3-O-[6-O-(α-L-鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷]、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-[4-O-(β-D-葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷]、槲皮素3-O-α-L-鼠李糖苷變化趨勢(shì)基本一致,均呈先上升后下降的趨勢(shì),見圖4。在80℃烘干條件下含量下降趨勢(shì)較小,制干后含量高于鮮品或與鮮品相當(dāng)。其他成分條件下制干后含量均有不同程度的降低。3.4黃酮類成分的含量變化分析3.5不同內(nèi)酯制干情況銀杏內(nèi)酯A,B,C及白果內(nèi)酯變化趨勢(shì)一致,呈先升高后降低的趨勢(shì),其中80℃和曬干趨勢(shì)明顯高于其他,且這4個(gè)內(nèi)酯制干后含量均為80℃>曬干>陰干>60℃>45℃>35℃,見圖6。3.6銀杏酸的變化白果新酸在干燥前后含量變化較小,而銀杏酸變化明顯,除35,45℃時(shí)呈平穩(wěn)下降趨勢(shì)外,均呈先升高后降低的趨勢(shì),其中80℃條件下最為明顯,見圖7。3.7主成分因子的選取及計(jì)算由于銀杏葉中各類成分在不同加工方式中變化不盡相同,故利用綜合評(píng)價(jià)法以確定適宜的產(chǎn)地初加工方法。以黃酮和內(nèi)酯類成分含量與對(duì)應(yīng)的組別組成矩陣,對(duì)其進(jìn)行了主成分分析,結(jié)果前4個(gè)主成分的特征值均大于1,說明前4個(gè)因子在影響銀杏葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)中起著主導(dǎo)作用,4個(gè)主成分的積累貢獻(xiàn)率達(dá)95.35%,能夠客觀地反映銀杏葉藥材的內(nèi)在質(zhì)量,故選用前4個(gè)主成分對(duì)不同干燥方法的銀杏葉進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。以各主成分因子得分與方差貢獻(xiàn)率乘積之和相加,得出各類成分總因子得分值F,其綜合評(píng)價(jià)函數(shù)如下。按綜合評(píng)價(jià)函數(shù)計(jì)算出不同樣品的綜合得分(F),并按其得分進(jìn)行降序排序,見表2。銀杏葉在80℃烘干條件下綜合評(píng)價(jià)明顯高于其他干燥方式,說明該干燥方法優(yōu)于其他方法,更適用于銀杏葉的干燥加工。4不同干燥條件對(duì)銀杏酸含量的影響通過測(cè)定線性關(guān)系、LOD和LOQ、日內(nèi)精密度和日間精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及準(zhǔn)確度,對(duì)該UP-LC-MS/MS方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明,這24個(gè)成分在測(cè)定范圍內(nèi)均顯示較好的線性關(guān)系(R2>0.9931),其LOD和LOQ分別在0.05~3.47,0.15~11.15mg·L-1;日內(nèi)精密度、日間精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD均小于5.0%;加樣回收率在95.0%~105.5%,其RSD均小于6.0%。表明該方法可以用于樣品中這24個(gè)成分的含量測(cè)定。研究表明,新鮮的植物材料中含有使次生代謝物分解的胞內(nèi)酶,“殺青”是利用高溫迅速破壞鮮藥中的各類酶活性,抑制相應(yīng)化學(xué)成分的酶促氧化反應(yīng)及水解反應(yīng),有利于各類活性成分的保持。兒茶素屬黃烷醇類物質(zhì),是2-苯基苯并吡喃的衍生物,性質(zhì)活潑,在酶的催化下易發(fā)生許多復(fù)雜的聚合、縮合反應(yīng)。3種兒茶素類成分在80℃烘干條件下均損失最少,60℃其次,可能是由于高溫使氧化該類成分的胞內(nèi)酶類失活,起到“殺青”的作用,使得銀杏葉中的兒茶素類成分大部分得以保留,而其他條件下兒茶素類成分含量均有所下降,其中曬干損失最多,可能是該類成分發(fā)生了氧化或縮合,而光照能加速這類反應(yīng)的進(jìn)行;槲皮素在曬干,60,45℃烘干條件下含量均呈明顯上升趨勢(shì),與之對(duì)應(yīng)的以槲皮素為苷元的4種糖苷在這3種干燥條件下含量呈下降的趨勢(shì),而在80℃干燥時(shí)卻保持在1個(gè)較平穩(wěn)的水平,說明適宜條件下少量糖苷在胞內(nèi)水解酶的作用下發(fā)生水解,80℃時(shí)水解酶失活。由此可以推斷另外4個(gè)苷元可能也存在這種變化,山柰酚的從無到有更印證了這點(diǎn),而芫花素在銀杏葉內(nèi)不形成苷,不存在這種變化。另外值得注意的是,這些成苷的苷元在低溫烘干或陰干條件下均有下降趨勢(shì),可見銀杏葉中不僅有分解糖苷的酶,也存在分解苷元的酶。研究表明銀杏中內(nèi)酯的合成是通過經(jīng)典的甲羥戊酸(mevalonate,MVA)途徑與新近發(fā)現(xiàn)的2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-ohosphate,MEP)途徑。在干燥過程中4種內(nèi)酯均呈升高的趨勢(shì),可見在某一階段可能發(fā)生了這一次生代謝過程,且高溫和光照能加速該過程的發(fā)生,之后內(nèi)酯又發(fā)生了分解或轉(zhuǎn)化導(dǎo)致其含量下降,而具體過程還值得更深入地研究;銀杏酸是銀杏葉的主要毒性成分,其在80℃烘干少量失水條件下含量迅速上升33.9%,可能是由于在干燥前期胞內(nèi)酶還未失活,在高溫刺激下加速了某種次生代謝物的轉(zhuǎn)化,之后銀杏酸含量又在短時(shí)間內(nèi)迅速下降41.1%,此時(shí)的酶已在長時(shí)間的高溫環(huán)境下失活,而銀杏酸本身具有較強(qiáng)的抗氧化活性,迅速被氧化致含量下降。而與鮮品相比,各干燥條件下銀杏酸含量僅下降了7.5%~37.4%,可見干燥過程中并不能有效的去除銀杏酸,故在使用中要注意銀杏酸的脫除。中藥材產(chǎn)地初加工是關(guān)系到中藥材質(zhì)量的關(guān)鍵,加工目的是提高藥效,利于包裝、貯藏和運(yùn)輸,加工不當(dāng)不但會(huì)引起藥材變色、變質(zhì)、霉?fàn)€,而且影響療效。本實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)表明:藥用品質(zhì)為80℃烘干>60℃烘干>45℃烘干>曬干>35℃烘干>陰干,可見80℃烘干也能起到“殺青”的作用,使得分解次生代謝物的胞內(nèi)酶失活,有效地防止了胞內(nèi)酶對(duì)有效成分的分解,有利于黃酮與內(nèi)酯類活性成分的保留,并且80℃烘干條件下耗時(shí)短,僅需40min,大大節(jié)約了時(shí)間,而曬干(3d)和陰干(6d)需要時(shí)間長,且受天氣因素影響較大,有效成分降解較多。因此建議將80℃快速烘干作為銀杏葉產(chǎn)地加工的方法。精密稱定相當(dāng)于0.5g干品的各樣品,置于50mL具塞錐形瓶中,精密加入20mL70%甲醇,靜置10h,室溫超聲提取30min,加70%甲醇補(bǔ)足失重,搖勻。提取液離心,上清液經(jīng)0.22μm的微孔濾膜濾過后,取續(xù)濾液作為供試品溶液。在80℃條件下,去甲銀杏雙黃酮和穗花杉雙黃酮的含量呈