高產(chǎn)油潛力能源微藻的篩選

高產(chǎn)油潛力能源微藻的篩選

人類文明的快速發(fā)展得益于化石能源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過88%的人工林瓦爾德出生在石化燃料中。但目前人類所面臨化石燃料的日益短缺和燃燒所帶來的對(duì)全球生態(tài)環(huán)境的破壞,已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類的生存。因此,積極尋找可再生的、環(huán)境友好型能源是當(dāng)今社會(huì)亟待解決的問題。生物柴油在能量密度、燃燒性等方面與石化柴油具有極高的相似性,被認(rèn)為是解決能源危機(jī)最好的出路。各國(guó)政府制定了許多政策、法規(guī)鼓勵(lì)本國(guó)生物柴油的發(fā)展,如美國(guó)能源部計(jì)劃到2030年實(shí)現(xiàn)30%的生物柴油替代化石燃料,歐盟于上世紀(jì)90年代就制定了生物柴油的標(biāo)準(zhǔn),我國(guó)海南也在2010年6月發(fā)布了“生物柴油B5地方標(biāo)準(zhǔn)”試行計(jì)劃。不同國(guó)家針對(duì)本國(guó)國(guó)情選擇適宜的油料作物積極發(fā)展生物柴油。微藻是一類以光合自養(yǎng)產(chǎn)生能量的低等植物,是自然界起源最早、分布最廣、種類和數(shù)量最大的生物質(zhì)資源。在一定條件下許多微藻能夠在細(xì)胞中大量積累儲(chǔ)藏性三酰甘油(微藻油)(類似于植物油),其最高含量可達(dá)到細(xì)胞干重的50%以上。與高等陸生油料作物相比,微藻的單位面積油產(chǎn)量是油料植物油產(chǎn)量的數(shù)十倍。因而,從微藻油的產(chǎn)量和品質(zhì)上考慮,它應(yīng)是解決全球能源短缺的重要非糧食原料。我國(guó)人口多,人均耕地面積少,因此,微藻作為生物柴油原料適宜在我國(guó)發(fā)展。國(guó)外利用微藻制備生物柴油的研究較早,其中規(guī)模較大的研究是1978~1996年由美國(guó)能源部資助的“AquaticSpeciesProgram(ASP)”項(xiàng)目2濃度、生長(zhǎng)速度快、生物量高的藻種。近兩年許多國(guó)際上能源生產(chǎn)或消耗的巨頭公司如殼牌石油(Shell)、英國(guó)石油公司(BP)、美國(guó)埃克森美孚(ExxonMobil)、雪佛龍石油(Chevron)、通用原子(GeneralAtomics)、通用電氣公司(GE)、波音(Boeing)、維珍航空公司(VirginAirlines)、日本航空公司(JapanAirlines)和新西蘭航空公司(NewZealandAirlines)都加入到了微藻能源的研發(fā)行列中并投入了大量資金。我國(guó)對(duì)微藻生物質(zhì)能源的研究開發(fā)起步較晚,大家對(duì)它認(rèn)識(shí)還不夠,隨著國(guó)外微藻能源研究開發(fā)的信息不斷傳入,各級(jí)科技部門對(duì)能源微藻產(chǎn)業(yè)的了解逐漸加深,在能源微藻產(chǎn)業(yè)方面的關(guān)注度和投入程度也在逐漸加大。獲得性能優(yōu)越的產(chǎn)油能源微藻是從事基礎(chǔ)研究和規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵,其中微藻培養(yǎng)過程中生物量的積累量和油脂含量是體現(xiàn)產(chǎn)油能源微藻應(yīng)用價(jià)值的兩個(gè)重要指標(biāo)。國(guó)內(nèi)外對(duì)于能源微藻的篩選和評(píng)價(jià)做了許多的工作,美國(guó)最早通過“AquaticSpeciesProgram”項(xiàng)目篩得了300株油脂含量高的藻株;意大利的Rodolfi等,從30株淡水和海洋微藻中篩選出一株擬微綠球藻(Nannochloropsissp.F&M-M24),其在氮限制的條件下,油脂含量達(dá)60%dw,單位體積總脂產(chǎn)率為204mg/L·d,并預(yù)測(cè)在陽光充足的熱帶地區(qū),該藻可以獲得每公頃30噸的油脂;Feng評(píng)價(jià)了一株普通小球藻(ChlorellavulgarisFACHB1068)同時(shí)處理廢水及生產(chǎn)油脂的潛能,結(jié)果表明,該藻可在人工廢水中生長(zhǎng),其最高總脂含量為42%dw,單位體積油脂產(chǎn)率可達(dá)147mg/L·d;目前國(guó)內(nèi)對(duì)于微藻脂類研究的相關(guān)工作大多集中在一些餌料微藻,如小球藻(Chlorellasp.)、等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)和一些赤潮藻,如鹽生卡盾氏藻(Chattonellasubsalsa)、角毛藻(Chaetocerossp.)、假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)、裸甲藻(Gymnodiniumsp.)等[14,15,16,17,18,19],在藻種資源拓展方面缺乏一定的創(chuàng)新性,限制了微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。自然界藻類種類多,微藻資源尤為豐富。篩選生長(zhǎng)速度快、生物量和油脂含量高、易于培養(yǎng)的優(yōu)良能源微藻,是實(shí)現(xiàn)能源微藻規(guī)?；囵B(yǎng)的前提和保障。本研究利用一套高效的微藻培養(yǎng)評(píng)價(jià)系統(tǒng),對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的20株野生型淡水和海洋微藻進(jìn)行了篩選和評(píng)價(jià),旨在獲得生長(zhǎng)速度快、生物量和油脂含量高的藻株,為后續(xù)油脂生產(chǎn)條件優(yōu)化及產(chǎn)油代謝生理方面工作提供基礎(chǔ),同時(shí)為利用光合生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)提供重要的種質(zhì)資源。1材料和方法1.1藻類藻類20株微藻均由暨南大學(xué)水生生物研究中心實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用藻類學(xué)實(shí)驗(yàn)室微藻種質(zhì)庫(kù)提供,各藻種的具體信息見表1。1.2圖1:《全球最優(yōu)條件》圖利用ue54f3.0cm柱狀光生物反應(yīng)器批次培養(yǎng),裝置示意圖見圖1。培養(yǎng)溫度25±1℃,24h連續(xù)光照,光照強(qiáng)度為200μmol/m2s,持續(xù)通入加富的壓縮空氣(1%CO2),淡水微藻的培養(yǎng)采用BG-11培養(yǎng)基,海水微藻采用改良的海水培養(yǎng)基。1.3光生物反應(yīng)器ue54f3.0將原藻種接入500ml三角瓶中活化擴(kuò)培5~6天,然后轉(zhuǎn)接至ue54f6.5cm柱狀光生物反應(yīng)器中,通氣培養(yǎng)5~6天,待藻細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期,接種至ue54f3.0cm柱狀光生物反應(yīng)器,初始OD750約為0.5,每株微藻設(shè)置兩個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)周期為16天,每?jī)商鞙y(cè)定干重(Dryweight,dw)、OD750、色素含量,分別離心收集初始接種時(shí)和第16天的藻細(xì)胞,凍干后分析測(cè)定總脂含量。1.4測(cè)量1.4.1藻細(xì)胞干重的提取混合纖維濾膜(Φ50mm,0.45μm)80℃烘干至恒重,取一定體積藻液抽濾,帶有藻細(xì)胞的濾膜同樣置于80℃烘箱中烘干至恒重,干燥器中冷卻后稱重,得到藻細(xì)胞干重。1.4.2測(cè)定了色素含量1.4.3總脂含量測(cè)定1.4.4計(jì)算單位體積生物量產(chǎn)率和單位體積總脂產(chǎn)量的方法2結(jié)果2.12微藻最高生物量的測(cè)定結(jié)果在相同光照強(qiáng)度(200μmol/m2s)、溫度(25±1℃)和通氣量等培養(yǎng)條件下,20株微藻生長(zhǎng)曲線如圖2a、圖2b、圖2c所示,N.oleoabundans、N.excentricum、P.tricornutum分別第6天、第8天、第10天出現(xiàn)平臺(tái)期后,生物量即開始下降,其余16株微藻在經(jīng)歷靜止期、對(duì)數(shù)期后,至第16天生物量的增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定,以微藻培養(yǎng)周期內(nèi)出現(xiàn)的最高生物量(Maximaldryweight)作為評(píng)價(jià)其性能的指標(biāo)較收獲時(shí)更具有科學(xué)性。將20株微藻最高生物量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,如圖3所示,生物量超過6.0g/L的微藻有4株,它們分別為N.oculata、S.sp、P.polymorphum、H.saccatum;生物量在5.0~6.0g/L之間的微藻8株,它們各為C.ellipsoideum、C.granulosum、C.nivale、C.oleofacien、C.tatrense、C.ellipsoidea、C.augustae、H.marinum;生物量低于5g/L的微藻有8株。單位體積生物量產(chǎn)率可以反映藻細(xì)胞生物量的積累速率,由圖4可以看出,20株微藻單位體積生物量產(chǎn)率與最高生物量呈正相關(guān),生物量產(chǎn)率最高藻株為N.oculata,值為0.47g/L·d;N.oleoabundans、C.vulgaris、C.zofingensis、B.minor、N.excentricum、P.tricornutum、C.marina的生物量產(chǎn)率小于0.25g/L·d,其余13株微藻的單位體積生物量產(chǎn)率均在0.30~0.38g/L·d之間。2.2總脂收獲量和總脂單位體積產(chǎn)率20株微藻總脂含量如表2所示,全部微藻總脂含量均大于10%dw,不同種類微藻總脂含量差異較大,總脂含量超過50%dw的微藻有1株,為S.sp.,總脂含量在40%~50%dw之間的有6株,它們是C.tatrense、C.oleofacien、C.zofingensis、C.ellipsoidea、C.augustae、P.polymorphum,總脂含量在30%~40%dw之間的有8株,小于30%dw的有5株。僅利用生物量或總脂含量一項(xiàng)指標(biāo),作為高產(chǎn)油藻株的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),較為片面,據(jù)此引入總脂收獲量(totallipidyield)和總脂單位體積產(chǎn)率(totallipidvolumetricproductivity),總脂收獲量為總脂含量與生物量的乘積,表示實(shí)際收獲的油脂量(g/L),總脂產(chǎn)率為單位時(shí)間總脂的產(chǎn)量(mg/L·d),反映藻細(xì)胞油脂積累速率。由表2可以看出,總脂收獲量和總脂產(chǎn)率同時(shí)大于2.0g/L和120mg/L·d的微藻有9株,它們分別為S.sp.、C.tatrense、N.oculata、C.oleofacien、P.polymorphum、C.augustae、C.ellipsoidea、C.ellipsoideum、C.nivale,對(duì)上述9株微藻的生物量與總脂含量分析可得,它們的生物量均大于5.5g/L,總脂含量大于35%dw,將其選出作為后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)材料。在其余11株藻中,C.vulgaris、C.zofingensis總脂含量大于35%,但其生物量較低,僅為3.0g/L左右,H.saccatum生物量雖高(6.03g/L),但其總脂含量?jī)H為26.8%dw,不具備產(chǎn)業(yè)化潛力。2.3種微藻葉綠素、類胡蘿卜素含量的變化規(guī)律在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi),20株微藻培養(yǎng)物的顏色出現(xiàn)明顯差異,C.marina,C.vulgaris,C.zofingensis,N.excentricum在培養(yǎng)周期內(nèi)始終為綠色,其余16株,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均變?yōu)辄S色。依據(jù)微藻培養(yǎng)液顏色和總脂含量高低,4種典型代表微藻如表3所示。分析其葉綠素、類胡蘿卜素含量及Car/Chl.(a+b)的變化規(guī)律,如圖5所示。由圖4a可以看出,4種類型微藻細(xì)胞葉綠素含量均出現(xiàn)先快速上升,而后下降的趨勢(shì),但葉綠素降低的程度存在差異,S.sp.葉綠素降低最快,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),葉綠素降低比例高達(dá)75%,而H.saccatum、C.zofingensis、C.marina葉綠素降低比例較少,分別為28%,32%,21%。從圖4b看出S.sp與H.saccatum的類胡蘿卜素含量高于C.marina和C.zofingensis。在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi),S.sp的Car./Chl.(a+b)一直處于上升狀態(tài),第16天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)比初始接種增加了4倍,C.marina和C.zofingensis的變化較為穩(wěn)定,H.saccatum變化趨勢(shì)與S.sp.一致,但上升幅度較小。3海洋微藻的篩選微藻相對(duì)于傳統(tǒng)的油料作物具有明顯的優(yōu)勢(shì),已成為第二代生物柴油生產(chǎn)的理想原料,但微藻油脂生產(chǎn)中存在較多瓶頸,制約了微藻生物柴油成本的降低。Chisti2007年按照封閉式光生物反應(yīng)器的生產(chǎn)能力,估算微藻生物柴油價(jià)格約為19元/升,而目前石化柴油的價(jià)格為6.1元/升,兩者成本差距較大,如何降低微藻油生產(chǎn)成本,實(shí)現(xiàn)其商業(yè)化運(yùn)作,是迫切需要解決的問題,提高藻種生物量和油脂含量,或利用含有高附加值物質(zhì)的藻株生產(chǎn)生物柴油,是降低微藻油成本較為理想的途徑。利用分子生物學(xué)手段對(duì)藻種進(jìn)行改造,可以提高藻種的油脂含量和環(huán)境適應(yīng)性,但該研究費(fèi)時(shí)且花費(fèi)較大,而且在一些國(guó)家禁止轉(zhuǎn)基因生物的使用。自然界中存在許多野生型油脂含量高且生長(zhǎng)速率快的微藻,通過自然篩選獲得高產(chǎn)油藻株是一種快捷的途徑。最早的美國(guó)ASP計(jì)劃,從環(huán)境中篩選出了300株油脂含量高的藻株,王立柱從滇池中分離得到了一株小球藻,其最高油脂產(chǎn)量可達(dá)100.2mg/L·d,生物量產(chǎn)率可達(dá)332.8mg/L·d,寧波大學(xué)王金娜等對(duì)63株海洋微藻產(chǎn)油性能進(jìn)行評(píng)價(jià),得到3株產(chǎn)油微藻,它們是:假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana),蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa),綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)。本文以實(shí)驗(yàn)室保藏的20株野生淡水和海洋微藻為研究對(duì)象,設(shè)置相同的培養(yǎng)條件,比較它們的生物量和總脂含量等指標(biāo),篩選具有產(chǎn)業(yè)化潛力的能源藻株。篩選得到了9株油脂含量高(大于35%)且生物量高(大于5.5g/L)的藻株,其中最具產(chǎn)業(yè)化潛力的藻株為S.sp,其總脂含量、總脂收獲量和單位體積總脂產(chǎn)率分別為55.9%dw、3.5g/L和218.7mg/L·d,與已有的研究報(bào)道相比,上述數(shù)據(jù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。Sobczuka研究連續(xù)培養(yǎng)條件下小索囊藻(Choricystisminor)的總脂產(chǎn)率為82mg/L·d,Rodolfi從30株微藻中篩選得到了一株油脂含量高的擬微綠球藻(Nannochloropsissp.F&M-M24),該藻在氮充足狀態(tài)下,總脂含量為32%dw,總脂產(chǎn)率為117mg/L·d,而在缺氮培養(yǎng)條件下,總脂含量達(dá)到60%dw,總脂產(chǎn)率為204mg/L·d,DelaPena報(bào)道雙眉藻(Amphora)在氮充足條件下,總脂含量可達(dá)51%dw,總脂產(chǎn)率為160mg/L·d,Li等報(bào)道富油新綠藻(Neoclorisoleoabundans)在氮充足條件下總脂含量為36%dw,總脂產(chǎn)率為136mg/L·d。將上述9株產(chǎn)油微藻選出,作為后續(xù)油脂生產(chǎn)條件優(yōu)化、產(chǎn)油代謝生理及利用光合生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的種質(zhì)資源。自然界中存在超過20萬種以上的微藻種類,不同微藻在種間或株系間油脂含量存在較大差異。據(jù)報(bào)道富油微藻主要集中在綠藻門(Chlorophytes)、硅藻綱(Bacillariophytes)、金藻門(Crysophytes)和黃藻門(Xanthophytes)中,而藍(lán)藻門(Cyanobacteria)中分布相對(duì)較少,Griffiths等對(duì)51種微藻的種類、總脂含量和總脂產(chǎn)率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,