6種常見(jiàn)海洋微藻硝酸還原酶活性測(cè)定方法的比較

6種常見(jiàn)海洋微藻硝酸還原酶活性測(cè)定方法的比較

氮是海洋浮游植物生長(zhǎng)和繁殖所必需的養(yǎng)分，它是許多海拔高度影響浮游植物生長(zhǎng)的因素。大量研究表明,在許多海區(qū)硝酸鹽是浮游植物中氮的主要來(lái)源。硝酸鹽經(jīng)浮游植物吸收后,在體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列酶的還原作用,最終轉(zhuǎn)化成為氨氮后合成其它有機(jī)物質(zhì)。硝酸還原酶(EC.1.6.6.1,縮寫(xiě)NR)是1種胞內(nèi)酶,普遍存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),可在電子供給體還原型輔酶I(NAD(P)H)的參與下將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽,是硝酸鹽同化中第一個(gè)酶,也是限速酶,處于植物氮代謝的關(guān)鍵位置,其活力的大小直接影響了硝酸鹽的生物利用度,在海洋生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過(guò)程中占有極其重要的地位。文獻(xiàn)報(bào)道的硝酸還原酶活性(Nitratereductaseactivity,NRA)測(cè)定方法總體上可分為2種:離體法(invitromethod或cell-freemethod)和活體法(invivomethod或insitumethod)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中,大部分研究者僅采用上述2種活性方法中的1種測(cè)定了不同海洋微藻的NRA,只有少數(shù)研究涉及了2種方法的比較,但不同研究所得結(jié)果缺乏一致性,因此,針對(duì)不同的海洋微藻,確立合適的NRA測(cè)定方法是十分必要的。本文對(duì)6種常見(jiàn)海洋微藻NRA測(cè)定的離體法和活體法測(cè)定條件進(jìn)行了初步探討,并在此基礎(chǔ)上對(duì)2種測(cè)定方法進(jìn)行了分析比較,以期能確立適合所選藻種的NRA測(cè)定方法,為進(jìn)一步開(kāi)展它們的NR研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1浮游植物的培養(yǎng)所用藻種塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)、東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、強(qiáng)壯前溝藻(Amphidiniumcarterae)、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、新月菱形藻(Nitzchiaclosterium)、旋鏈角毛藻(Chaetoceroscurvisetus)均為中國(guó)海洋大學(xué)海洋污染生態(tài)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存種。浮游植物的培養(yǎng)采用f/2營(yíng)養(yǎng)液配方,培養(yǎng)條件:溫度(20±1)℃,明暗周期12h∶12h,光源為白色日光燈,光照強(qiáng)度約為40μmol·m-2·s-1。在培養(yǎng)過(guò)程中,培養(yǎng)液及培養(yǎng)器皿采用蒸汽滅菌器于121℃加熱20min進(jìn)行濕熱滅菌。1.2no2-n量的檢測(cè)硝酸還原酶活性的測(cè)定方法參考Berges和Harrison于1995年建立的離體法及2000年Hung等人改進(jìn)的活體法進(jìn)行。其活力以單位時(shí)間內(nèi)所生成的NO2-N量或NADH的消耗量來(lái)表征。其中NO2-N生成量采用磺胺—α-萘乙二胺顯色比色法測(cè)定,于540nm下測(cè)定吸光值(A540);NADH消耗量以340nm下測(cè)定的吸光值(A340)來(lái)計(jì)算(A340=εcl,式中ε=6.22mmol·L-1·cm-1)。1.3藻細(xì)胞破碎程度的測(cè)定取一定體積的藻液,于5000r/min下離心,并以pH7.9的磷酸緩沖溶液(PO3?443-:200mmol·L-1)洗滌、離心2次獲取藻細(xì)胞。將藻細(xì)胞置于組織研磨器中,加入提取液進(jìn)行勻漿研磨不同時(shí)間后,考查藻細(xì)胞的破碎程度。藻細(xì)胞的破碎程度以完整細(xì)胞數(shù)目的降低來(lái)衡量,計(jì)數(shù)方法為顯微鏡目視計(jì)數(shù)法。各藻種設(shè)平行實(shí)驗(yàn)3組,具體勻漿時(shí)間見(jiàn)表1。1.4反應(yīng)時(shí)間對(duì)nra藻細(xì)胞采用WhatmanGF/F玻璃纖維膜(Ф25mm)減壓過(guò)濾收集。將樣品置于裝有1cm3pH7.9的磷酸緩沖溶液(PO3?443-:200mmol·L-1)和50mm3甲苯的燒杯內(nèi),于漩渦振蕩器上振蕩不同時(shí)間后,參照文獻(xiàn)加入反應(yīng)物,設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為5min,測(cè)定NRA。各藻種設(shè)平行實(shí)驗(yàn)3組,具體振蕩時(shí)間見(jiàn)表1。1.5nadh與no2-n生成量的檢測(cè)取一定體積的不同藻種的藻液,參考1.3及1.4所確立的提取時(shí)間和振蕩時(shí)間,分別采用離體法和活體法在室溫下測(cè)定NO2-N生成量(或NADH的消耗量)與酶促反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系,以確定進(jìn)行NRA測(cè)定時(shí)所需的最佳時(shí)間。各藻種設(shè)平行實(shí)驗(yàn)3組。2結(jié)果與討論2.1藻細(xì)胞破碎程度不同藻種的細(xì)胞破碎程度隨研磨時(shí)間的變化見(jiàn)圖1。由圖1可知,本實(shí)驗(yàn)所選用的6種海洋微藻在提取液中研磨5min后,90%以上的藻細(xì)胞已經(jīng)破碎。藻細(xì)胞破碎程度視藻種的不同而有所變化,其中強(qiáng)壯前溝藻和東海原甲藻較難破碎(破碎程度分別為90.6%和92.5%),塔瑪亞歷山大藻破碎最完全(破碎程度達(dá)到100%)。因此,可將提取時(shí)間設(shè)定為5min。2.2間的關(guān)系介紹在6種海洋微藻NRA活體法實(shí)驗(yàn)中,NO2-N生成量與振蕩時(shí)間的關(guān)系如圖2所示。從圖2中可以看出,雖然各藻種NO2-N生成速率不同,但振蕩時(shí)間達(dá)到6min后,各藻NO2-N生成量隨時(shí)間的變化都很小,所以,可將振蕩時(shí)間設(shè)定為6min。2.3種藻nra的線(xiàn)性關(guān)系圖3表明了不同藻種采用離體法和活體法進(jìn)行NRA測(cè)定時(shí),NO2-N生成量(或NADH的消耗量)與酶促反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系,其中東海原甲藻及塔瑪亞歷山大藻的離體法實(shí)驗(yàn)測(cè)得的NRA以NADH的消耗量表示,其余實(shí)驗(yàn)均以NO2-N的生成量來(lái)表征。根據(jù)1.2所述的硝酸還原酶活力表征方法可知,NRA的測(cè)定必須在NO2-N生成量(或NADH的消耗量)與時(shí)間呈現(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行,其直線(xiàn)斜率即為NRA。以新月菱形藻和東海原甲藻離體法為例進(jìn)行說(shuō)明。由圖3A和3B可知,采用離體法測(cè)定上述2種藻NRA時(shí),當(dāng)酶促反應(yīng)時(shí)間分別超過(guò)40min和45min時(shí),NO2-N生成速率或NADH消耗速率明顯減慢,NR開(kāi)始失活。因此,在以離體法測(cè)定此兩種藻NRA時(shí),所選擇的酶促反應(yīng)時(shí)間應(yīng)分別<40min和45min,否則,計(jì)算的NRA在數(shù)值上必然低于真實(shí)值。另外,對(duì)于中肋骨條藻和旋鏈角毛藻,當(dāng)采用離體法測(cè)定NRA時(shí),在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間內(nèi),均表現(xiàn)了良好的線(xiàn)性關(guān)系(見(jiàn)圖3a),提示在實(shí)驗(yàn)條件下,2種藻的NR活性沒(méi)有降低,但不排除當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí),NR失活的可能性。各海洋微藻2種方法測(cè)定NRA的線(xiàn)性時(shí)間見(jiàn)表2。從以上分析可以看出,6種海藻的NR間存在著種屬差異。若確定各藻通用的酶促反應(yīng)時(shí)間,需選擇真正能體現(xiàn)各藻種NRA活性的時(shí)間,綜合比較各海藻的線(xiàn)性時(shí)間可得:當(dāng)采用離體法測(cè)定NRA時(shí),酶促反應(yīng)時(shí)間應(yīng)設(shè)定為30min;采用活體法測(cè)定NRA時(shí),酶促反應(yīng)時(shí)間應(yīng)設(shè)定為10min。但此時(shí)間是否適用于其它的海洋浮游藻類(lèi),還有待于進(jìn)一步研究。2.42樣品的提取:從提取nr到激活nra對(duì)于實(shí)驗(yàn)涉及的每種海洋微藻,取同樣體積的相同藻液,分別采用離體法和活體法進(jìn)行NRA測(cè)定,酶促反應(yīng)時(shí)間如上文所述:離體法為30min,活體法為10min,所得結(jié)果見(jiàn)表3。在表3中,為方便進(jìn)行2種方法NRA測(cè)定結(jié)果的比較,將離體法所得的NRA定為100,活體法NRA所示數(shù)值則為相對(duì)于離體法NRA所得的相對(duì)值。結(jié)果表明:除東海原甲藻外,對(duì)于其余5種海洋單細(xì)胞藻,離體法測(cè)得的NRA均較活體法高,2種方法NRA視藻種的不同相差倍數(shù)在1.23～4.17之間,差異顯著(n=8,t-檢驗(yàn),塔瑪亞歷山大藻:P<0.05;其余各藻P<0.01)。另外,對(duì)比2種方法的實(shí)驗(yàn)精度可知,相對(duì)于活體法,離體法具有更好的重現(xiàn)性和精密度(見(jiàn)表3),這與Hochman等人的研究結(jié)果相反。但Hochman采用的離體法為Eppley或Packard建立的方法,活體法為Hochman本人所建立,與本文方法略有不同。離體法是在加入提取液后通過(guò)破碎藻細(xì)胞來(lái)提取NR的方法,在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,提取液的組分會(huì)對(duì)NRA的測(cè)定值產(chǎn)生一定的影響。與Eppley或Packard的離體法相比,本文采用的Berges建立的離體法提取液中增加了EDTA、曲拉通X-100及BSA等3種組分,其中,EDTA可通過(guò)絡(luò)和作用消除金屬對(duì)NR的失活作用;表面活性劑曲拉通X-100可將離心廢渣中殘余的NR充分提取出來(lái);BSA可降低蛋白酶對(duì)NR的分解作用,能更好地降低NR在提取過(guò)程中造成的損失。實(shí)際上,Berges離體法是Eppley或Packard離體法的改進(jìn)方法?；铙w法是加入合適的試劑增加細(xì)胞壁(膜)的通透性,使生成的NO2-N擴(kuò)散到反應(yīng)液進(jìn)行NRA測(cè)定的方法。本文所用的活體法與Hochman活體法的區(qū)別在于在加入反應(yīng)物后加以振蕩以加速NO2-N的擴(kuò)散,進(jìn)而提高NRA的測(cè)定值。通過(guò)以上的分析可以看出,在Hochman的研究中,無(wú)論是采用離體法還是活體法測(cè)得的NRA均存在低估的可能性,這也是引起Hochman的研究結(jié)果與本文研究結(jié)果不同的主要原因。對(duì)于東海原甲藻而言,雖然在本文條件下,離體法所測(cè)NRA小于活體法,并且存在明顯差異(n=8,t-檢驗(yàn),P<0.01),但并不能說(shuō)明,活體法較離體法更適用于東海原甲藻的NRA測(cè)定。對(duì)于NR這種多輔基(酶)的細(xì)胞內(nèi)酶而言,在離體法提取過(guò)程中,結(jié)合較松的輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)會(huì)從NR亞基上發(fā)生不同程度的脫落,其脫落程度也存在著種屬差異,在反應(yīng)液中適量添加FAD可明顯提高某些藻種的NRA,但對(duì)某些藻種卻沒(méi)有影響。而活體法直接采用鮮活細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持了NR結(jié)構(gòu)的完整性,未引起輔酶FAD含量的降低。據(jù)此推測(cè),在本文條件下東海原甲藻離體法測(cè)得的NRA相對(duì)較低的原因,可能是輔酶FAD在提取過(guò)程中的缺失所致。因此,離體法和活體法在東海原甲藻NRA測(cè)定上的優(yōu)劣還有待于進(jìn)一步研究。離體法和活體法是2種原理不同的方法,在進(jìn)行NRA測(cè)定時(shí)各有利弊。離體法在NR提取過(guò)程中,因藻種的不同,會(huì)造成某些藻NR的一些輔助因子如:NADH,FAD的缺失,且缺失程度存在種屬差異;另外,細(xì)胞中NR的提取效率及其活性保持程度也會(huì)受到提取液成分的影響,可能會(huì)引起某些藻種NRA的測(cè)定值低于真實(shí)值。但離體法保證了各底物在酶促反應(yīng)過(guò)程中的充分接觸及生成產(chǎn)物的及時(shí)釋放,實(shí)驗(yàn)精密度好?；铙w法是在增加細(xì)胞壁(膜)通透性、提高底物NO3-N、NADH和反應(yīng)產(chǎn)物NO2-N進(jìn)出藻細(xì)胞速率的基礎(chǔ)上建立的,雖然保全了NR的結(jié)構(gòu),但細(xì)胞壁(膜)通透性的提高程度、底物和反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)出藻細(xì)胞的速率、NO2-N生成后被藻細(xì)胞吸收、同化的速率都將對(duì)活體法測(cè)得的NRA有重要影響,導(dǎo)致活體法實(shí)驗(yàn)可控性差、重現(xiàn)性低,本文的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。綜合考慮2種方法測(cè)得各藻NRA的表觀(guān)值和實(shí)驗(yàn)精度,離體法取得了讓人滿(mǎn)意的結(jié)果。但本文條件下的離體法實(shí)驗(yàn)沒(méi)有考慮FAD缺失所帶來(lái)的影響,所得NRA值可能會(huì)低于實(shí)際值,因此,離體法實(shí)驗(yàn)條件還有待于進(jìn)一步優(yōu)化。3海洋微藻nr活性的測(cè)定作者采用Berges和H