分子標(biāo)記輔助選擇育種省名師優(yōu)質(zhì)課賽課獲獎?wù)n件市賽課一等獎?wù)n件

第十四章分子標(biāo)識輔助選擇育種作物育種：創(chuàng)造變異，選擇優(yōu)良變異傳統(tǒng)育種選擇方法：依據(jù)植株表現(xiàn)型選擇缺點：依靠育種家經(jīng)驗；育種年限長；受環(huán)境條件影響大（如抗病、抗蟲等）經(jīng)過與目標(biāo)性狀基因連鎖、易于識別性狀作為標(biāo)識，對目標(biāo)性狀進(jìn)行間接選擇（相關(guān)選擇）第一節(jié)分子標(biāo)識輔助選擇意義第1頁遺傳標(biāo)識：可遺傳、特殊、易于識別表現(xiàn)形式遺傳標(biāo)識類型：形態(tài)標(biāo)識、細(xì)胞學(xué)標(biāo)識、生化標(biāo)識、分子標(biāo)識分子標(biāo)識：直接反應(yīng)基因組間DNA差異遺傳標(biāo)識分子標(biāo)識輔助選擇：經(jīng)過與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖分子標(biāo)識來判斷控制目標(biāo)性狀基因是否存在優(yōu)點：不需要考慮作物生長條件和環(huán)境條件；降低基因互作干擾；快速壘集目標(biāo)基因，加緊育種進(jìn)程；降低群體種植規(guī)模等第2頁簡稱RFLP標(biāo)識第二節(jié)分子標(biāo)識類型及原理一、分子標(biāo)識類型1、以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)DNA標(biāo)識技術(shù)（insituhybridization）限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)識（Restrictionfragmentlengthpolymorphisms）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)識（Variablenumberoftandemrepeats）簡稱VNTR標(biāo)識原位雜交簡稱ISH第3頁2、基于PCRDNA標(biāo)識1）單引物PCR標(biāo)識2）雙引物選擇性擴(kuò)增PCR標(biāo)識3）經(jīng)過克隆、測序來構(gòu)建特殊雙引物PCR標(biāo)識。

第4頁限制性酶切片段選擇性擴(kuò)增3、基于PCR與限制性內(nèi)切酶技術(shù)相結(jié)合DNA標(biāo)識分為兩類PCR擴(kuò)增片段限制性酶切如AFLP如CAPs第5頁Singlenucleotidepolymorphism，4、基于單核苷多態(tài)性DNA標(biāo)識單核苷酸多態(tài)性簡稱SNP第6頁用限制性內(nèi)切酶酶切不一樣個體基因組DNA后，含有與探針序列同源酶切片段在長度上差異。二、主要分子標(biāo)識1、RFLP（RestrictionFragmentLengthpo1ymorpams）限制性片段長度多態(tài)性1980，Bostein第7頁堿基替換、插入、缺失或重復(fù)造成某種限制性內(nèi)切酶（restrictionenzymes）酶切位點增加或喪失以及內(nèi)切酶酶切位點間DNA片段改變基因組DNA序列上改變（1）RFLP標(biāo)識原理第8頁（2）RFLP標(biāo)識分析步驟第9頁

（3）RFLP標(biāo)識特點優(yōu)點①數(shù)目幾乎無限②共顯性③能夠利用現(xiàn)有探針，含有種族特異性④RFLP標(biāo)識遍布全基因組⑥重復(fù)性好第10頁缺點成本較高;需要許多克隆探針；一個探針只能產(chǎn)生一個多態(tài)位點；所需DNA量大(5～15μg)；易造成環(huán)境污染第11頁隨機(jī)排列寡聚脫氧核苷酸單鏈引物（10個核苷酸）。經(jīng)過PCR擴(kuò)增染色體組DNA所取得長度不一樣多態(tài)性DNA片段。2、RAPD（RandomAmplificationPolymorphismDNA）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA1990,Williams第12頁特異性取決于引物與模板DNA結(jié)合特異性。PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）Mullis等(1985)PCR反應(yīng)：變性、復(fù)性、延伸。第13頁RAPD與經(jīng)典PCR反應(yīng)區(qū)分①引物②反應(yīng)條件③擴(kuò)增產(chǎn)物第14頁（2）RAPD標(biāo)識特點優(yōu)點1）可檢測未知序列基因組DNA2）引物無種族特異性3）RAPD技術(shù)簡單第15頁4）單個引物可產(chǎn)生幾個多態(tài)位點第16頁5）經(jīng)過克隆測序可轉(zhuǎn)化成SCARSCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)識第17頁缺點1）再現(xiàn)性差2）顯性遺傳3）存在共遷移問題第18頁3、AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性1993，Zabeaumarc和Vospieter是對限制性酶切片段選擇性擴(kuò)增第19頁（1）AFLP標(biāo)識原理基因組DNA進(jìn)行雙酶切人工接頭連接PCR反應(yīng)引物凝膠電泳第20頁AFLP擴(kuò)增數(shù)量由酶切頻率較低限制酶在基因組中酶切位點數(shù)量決定。限制性酶酶切頻率較高限制性酶（frequentcutter），酶切頻率較低限制性酶（rarecutter）產(chǎn)生易于擴(kuò)增基因組DNA限制擴(kuò)增模板DNA片段數(shù)量第21頁3）選擇擴(kuò)增AFLP分析基本步驟1）限制性核酸酶雙酶切基因組DNA2）DNA片段兩端連接上特定接頭(oligonucleotideadapters)第22頁6）自顯影4）聚丙烯酰胺凝膠電泳5）凝膠轉(zhuǎn)移，干膠處理熒光標(biāo)識、銀染第23頁（2）AFLP標(biāo)識特點優(yōu)點

1）數(shù)目和種類很多

2）一次PCR反應(yīng)可檢測多個遺傳位點3）AFLP分析模板用量少4）分辨率高5）假陽性低，可靠性高6）AFLP標(biāo)識多數(shù)為顯性第24頁缺點分析成本高DNA純度及內(nèi)切酶質(zhì)量要求也比較高甲基化敏感酶易產(chǎn)生假假陽性第25頁(Variablenumbertandemrepeat)4、SSR（SimpleSequenceRepeat）1987，Nakamura生物基因組內(nèi)有一個短重復(fù)次數(shù)不一樣關(guān)鍵序列可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列簡稱VNTR小衛(wèi)星（minisatellites）微衛(wèi)星（microsatellites）第26頁簡單重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星DNA一類由1—6個堿基組成基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成DNA序列如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）nn代表重復(fù)次數(shù)，其大小在10～60之間第27頁微衛(wèi)星DNA兩端序列是相對保守單拷貝序列（1）SSR標(biāo)識原理依據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端單拷貝序列設(shè)計一對特異引物，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增每個位點微衛(wèi)星DNA序列，經(jīng)過電泳分析關(guān)鍵序列長度多態(tài)性。第28頁2）檢測一個單一多等位基因位點。（2）SSR標(biāo)識特點1）數(shù)量幾乎無限，檢測出多態(tài)性頻率極高3）多數(shù)為共顯性標(biāo)識第29頁使用SSR技術(shù)前提是需要知道重復(fù)序列兩翼DNA序列。4）重復(fù)性高，穩(wěn)定可靠5）需DNA樣品量少，對DNA質(zhì)量要求亦不苛刻第30頁引物設(shè)計采取2－4個核苷酸序列為基序（motifs），以其不一樣重復(fù)次數(shù)再加上幾個非重復(fù)錨定堿基Inter-simplesequencerepeatpolymorphicDNAISSR標(biāo)識相鄰SSR區(qū)域內(nèi)引物去擴(kuò)增中間單拷貝序列第31頁共顯性遺傳5、SCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)識普通步驟RAPD分析克隆片段兩端測序設(shè)計長為18～24bp引物PCR擴(kuò)增檢測高重復(fù)性優(yōu)點第32頁6、CAPS（CleavedAmplificationPolymorphismSequence-taggedSite）切割擴(kuò)增多態(tài)序列標(biāo)簽位點技術(shù)又稱PCR-RFLP基本步驟特定引物PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶酶切酶切產(chǎn)物凝膠電泳檢測第33頁CAPs標(biāo)識優(yōu)點①引物與限制酶組合非常多②

CAPS標(biāo)識呈共顯性③所需DNA量極少④結(jié)果穩(wěn)定可靠⑤操作簡便、快捷第34頁指基因組中長度為200—500bp，且核苷酸次序已知單拷貝序列，可采取PCR技術(shù)將其專一擴(kuò)增出來。7、STS（Sequence-taggedSites）序列標(biāo)簽位點簡稱序標(biāo)位YAC或cosmid插入末端序列引物起源RFLP單拷貝探針序列微衛(wèi)星序列表示基因序列第35頁很輕易在不一樣組合遺傳圖譜間進(jìn)行標(biāo)識轉(zhuǎn)移，且是溝通植物遺傳圖譜和物理圖譜中介。

8、表示序列標(biāo)簽（Expressedsequencetags，ESTs）表示基因部分序列共顯性遺傳突出優(yōu)點第36頁擴(kuò)增基因開發(fā)閱讀框（openreadingframes,ORFs）。引物17-18個堿基，包含13-14個堿基關(guān)鍵區(qū)域（5’10-11個堿基為填充區(qū)，隨即正向為CCGG，反向為AATT），關(guān)鍵區(qū)域后為3個選擇堿基。9、SRAP（Sequence-relatedamplifiedpolymorphism）相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性第37頁第38頁SRAP特點優(yōu)點1）每一反應(yīng)可得大量多態(tài)位點2）不需克隆任何序列，引物可用于不一樣生物；3）便利、簡單；4）重復(fù)性好；5）PCR產(chǎn)物可直接測序。第39頁基因組中每隔1000個堿基就存在一單堿基差異。普通經(jīng)過對PCR產(chǎn)物、基因組文庫、表示序列標(biāo)簽（EST）文庫測序而取得10、SNP（simplenucleotidepolymorphisms）單核苷酸多態(tài)性等位基因遺傳密碼單堿基差異。特點：數(shù)量大第40頁AChromosomeMapofTomato第三節(jié)主要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)識篩選一、遺傳圖譜構(gòu)建第41頁1、作圖群體建立（1）親本選配親本選擇標(biāo)準(zhǔn)親本間DNA多態(tài)性豐富；親本純度高；雜交后代可育。第42頁（2）群體類型×F1P1P2F2F2群體第43頁BC1群體第44頁RIL群體是雜交后代經(jīng)過多代自交而產(chǎn)生一個作圖群體，通常從F2代開始，采取單粒方法建立。常自交6-7代。重組近交系群體（recombinantinbredlines，RIL

）第45頁DH群體單倍體經(jīng)過染色體加倍形成二倍體第46頁一組遺傳背景相同或相近，只在個別區(qū)段存在差異株系近等基因系群體（Near-isogeneiclinesNIL）第47頁擬測交（Pseudo-testcross）群體復(fù)合雜交群體（CP群體）第48頁（3）群體大小構(gòu)建分子標(biāo)識骨架連鎖圖可用小群體150單株或家系。第49頁連鎖圖譜構(gòu)建理論是染色體交換和重組。AABB×abababABABabABba重組率可用來表示遺傳圖距，重組型配子最大百分比為50%，改變0-50%。圖距單位用厘摩（centi-Mergan,cM）表示，1cM大小大致符合1%重組率。2、圖譜構(gòu)建理論基礎(chǔ)第50頁兩位點存在連鎖(r＜0.5)概率與不連鎖概率(r=0.5)比

為確定兩位點之間存在連鎖，普通要求似然比大于1000，即LOD＞3；而否定連鎖存在，則要求似然比小于100，即LOD＜2。圖譜制作統(tǒng)計學(xué)原理①兩點測驗L(r)/L(0.5)概率之比可用似然比統(tǒng)計量來表示似然函數(shù)L()②多點測驗第51頁檢測作圖群體個體（株系）分子標(biāo)識基因型P1P2F112345678910111213141516171819202122BHAAHHAHBAAHHHABHABAHH123456789101112??????3、標(biāo)識基因型檢測第52頁4、圖譜構(gòu)建軟件利用DNA標(biāo)識數(shù)據(jù)，經(jīng)過作圖軟件構(gòu)建連鎖圖譜。MAPMKER/EXE3.0MapmangerQTX20Joinmap第53頁陸地棉（渝棉1號×T586）F2:7群體第54頁1、質(zhì)量性狀基因定位二、基因定位第55頁（1）近等基因系分析第56頁（2）分離群體分組混合分析

第57頁

1

11170

12135

131480

14215

15710

CMS育性恢復(fù)基因分子標(biāo)識第58頁控制數(shù)量性狀基因2、數(shù)量性狀基因定位數(shù)量性狀基因座（quantitativetraitloci,QTL）第59頁檢驗同一標(biāo)識不一樣基因型間數(shù)量性狀均值差異（1）QTL定位方法1）基于標(biāo)識分析方法均值差檢測法若差異顯著，則表明標(biāo)識與QTL連鎖。第60頁陸地棉（渝棉1號×T586）F2:7群體QTL定位第61頁2）基于性狀分析方法分離群體分群分析法第62頁選擇性基因型分析法第63頁

3、QTL定位軟件Mapmaker/QTL1.0MapManagerQTXQTLCartographerMapQTLWindowsCartographer第64頁4、QTL精細(xì)定位1）單個QTL精細(xì)定位連續(xù)用渝棉1號回交分子標(biāo)識輔助選擇渝棉1號T586T586渝棉1號群體大于1000第65頁可靠性取決于標(biāo)識與目標(biāo)基因連鎖程度。若只用一個標(biāo)識對目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，則標(biāo)識與目標(biāo)基因間連鎖必須非常緊密，才能夠到達(dá)較高正確率。第四節(jié)分子標(biāo)識輔助選擇（MAS）育種一、分子標(biāo)識輔助選擇遺傳基礎(chǔ)1、前景選擇對目標(biāo)基因選擇稱為前景選擇(foregroundselection)Hospital&Charcosset(1997)提出第66頁供體受體RRRrrr(1-r)22r(1-r)r2MRmrMRmr目標(biāo)基因與DNA標(biāo)識間遺傳距離位p親本中DNA標(biāo)識帶型F1雜種中DNA標(biāo)識帶型在F2分離群體中分子標(biāo)識類型即MM,Mm,mmMM類型分子標(biāo)識所代表目標(biāo)基因型及其頻率利用MAS遺傳基礎(chǔ)（以RFLP為例）M—抗性標(biāo)識R—抗性基因m—感病標(biāo)識r—感病基因第67頁

選擇正確率隨重組率增加而快速下降。重組值越小，其錯選率越低。假如要求最少選到一株目標(biāo)基因型概率為P，則必須選擇含有標(biāo)識基因型MM植株最少為：n＝log（1-P）/log（1-p）式中p＝（1－r）2第68頁第69頁對基因組中其它部分（即遺傳背景）選擇，稱為背景選擇（backgroundselections）。背景選擇對象幾乎包含了整個基因組，所以，這里牽涉到一個全基因組選擇問題，在分離群體中，因為在上一代形成配子時同源染色體之間會發(fā)生交換，所以每條染色體都可能是由雙親染色體重新組裝雜合體。2、背景選擇第70頁第71頁二、分子標(biāo)識輔助選擇優(yōu)越性1.克服性狀表現(xiàn)型判定困難2.允許早期選擇3.控制單一性狀多個（等位）基因利用4.允許同時選擇多個性狀5.可進(jìn)行性狀非破壞性評價和選擇6.從育種進(jìn)程考慮，可加緊育種進(jìn)程，提升育種效率第72頁三.分子標(biāo)識輔助選擇應(yīng)具備主要條件

A：與目標(biāo)基因緊密連鎖分子標(biāo)識B:簡便快捷標(biāo)識檢測方法第73頁Howtouseageneticmarkerformarker-assistedselectionWeaverCarrierSire+WW+++M1M2M1M2M3M3W=Weaver+=Normal第74頁目標(biāo)基因標(biāo)識篩選（genetagging）是進(jìn)行分子標(biāo)識輔助選擇（MAS）育種基礎(chǔ)。用于MAS育種分子標(biāo)識須具備三個條件：分子標(biāo)識與目標(biāo)基因緊密連鎖標(biāo)識實用性強(qiáng)，重復(fù)性好，而且能夠經(jīng)濟(jì)簡便地檢測大量個體。不一樣遺傳背景選擇有效。第75頁作物MAS育種須具備條件

分子標(biāo)識與目標(biāo)基因共分離或緊密連鎖，普通要求二者間遺傳距離小于5cM,最好1cM或更小。含有在大群體中利用分子標(biāo)識進(jìn)行篩選有效伎倆，主要是應(yīng)用PCR技術(shù)。篩選技術(shù)在不一樣試驗室間重復(fù)性好，且含有經(jīng)濟(jì)、易操作特點。含有實用化程度高并能幫助育種家作出抉擇計算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件。第76頁四、MAS育種方法（一）回交育種（二）SLS-MAS（三）MAS聚合育種第77頁受體親本×供體親本(不含優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因)F1×受體親本BC1目標(biāo)基因定位標(biāo)識輔助選擇中選BC1×受體親本(含優(yōu)質(zhì)基因)BC2BC3標(biāo)識輔助選擇標(biāo)識輔助選擇中選BC3(含優(yōu)質(zhì)基因)新育成優(yōu)質(zhì)品種(受體親本遺傳本背景+優(yōu)質(zhì)基因)自交目標(biāo)基因定位與標(biāo)識輔助回交育種相結(jié)合程序圖中選BC1×受體親本(含優(yōu)質(zhì)基因)第78頁

受體親本×供體親本A(無優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因A)

受體親本×供體親本B(無優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因B)F1(含優(yōu)質(zhì)基因A)×F1(含優(yōu)質(zhì)基因B)復(fù)雜雜種(分離群體)

受體親本×供體親本C(無優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因C)

中選雜種個體×F1(含優(yōu)質(zhì)基因A和B)(含優(yōu)質(zhì)基因C)復(fù)雜雜種(分離群體)

中選雜種個體×受體親本(含優(yōu)質(zhì)基因A、B和C)

新育成優(yōu)質(zhì)品種(受體親本遺傳背景+優(yōu)質(zhì)基因A、B和C)回交1~2代，標(biāo)識輔助選擇自交標(biāo)識輔助選擇標(biāo)識輔助選擇標(biāo)記輔助基因聚合與品質(zhì)改良相結(jié)合程序圖第79頁五、提升分子標(biāo)識篩選效率（一）多重PCR方法（二）用相斥相分子標(biāo)識進(jìn)行育種選擇（三）克服連鎖累贅（四）降低MAS育種成本第80頁

MAS育種研究范圍：1.分子標(biāo)識與資源評價（度量遺傳多樣性）2.分子標(biāo)識與親本選配3.MAS增強(qiáng)作物抗病性（轉(zhuǎn)移新抗性基因，抗性基因累加或聚合）4.MAS提升作物雜種產(chǎn)量

第81頁

品質(zhì)性狀分子標(biāo)識體系HMW—GS：2*、7