米曲霉的介紹

菌種特點(diǎn):米曲霉(Asp.oryzae)屬于真菌菌落生長(zhǎng)快，10d直徑達(dá)5?6cm,質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色。背面無色。分生抱子頭放射狀，一直徑150?300um，也有少數(shù)為疏松柱狀。分生抱子梗2mm左右。近頂囊處直徑可達(dá)12~25um，壁薄，粗糙。頂囊近球形或燒瓶形，通常40?50um。上覆小梗，小梗一般為單層，12?15um，偶爾有雙層，也有單、雙層小梗同時(shí)存在于一個(gè)頂囊上。分生抱子幼時(shí)洋梨形或卵圓形，長(zhǎng)大后多變?yōu)榍蛐位蚪蛐危话?.5um，粗糙或近于光滑。(半知菌亞門絲抱鋼絲抱目從梗抱科曲霉屬真菌中的一個(gè)常見種)。菌落生長(zhǎng)較快，質(zhì)地疏松。初呈白色、黃色，后轉(zhuǎn)黃褐色至淡綠褐色，背面無色，分布甚廣，主要在糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物和土壤等處。是我國(guó)傳統(tǒng)釀造食品醬和醬油的生產(chǎn)菌種。也可生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等。會(huì)引起糧食等工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品霉變。米曲霉(Aspergillusoryzae)具有豐富的蛋白酶系，能產(chǎn)生酸性、中性和堿性蛋白酶,其穩(wěn)定性高，能耐受較高的溫度,廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)中。米曲霉也是美國(guó)食品與藥物管理局和美國(guó)飼料公司協(xié)會(huì)1989年公布的飼料公司協(xié)會(huì)1989年公布的40余種安全微生物菌種之一。米曲霉米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，將原料中的直鏈、支鏈淀粉隆解為糊精及各種低分子糖類，如麥芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，而且可以使輔料中粗纖維、植酸等難吸收的物質(zhì)降解，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、保健功效和消化率，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生產(chǎn)曲酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)，并已被安全地應(yīng)用了1000多年。米曲霉是理想的生產(chǎn)大腸桿菌不能表達(dá)的真核生物活性蛋白的載體。米曲霉基因組所包含的信息可以用來尋找最適合米曲霉發(fā)酵

的條件，這將有助于提高食品釀造業(yè)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。米曲霉基因組的破譯，也為研究由曲霉屬真菌引起的曲霉病提供了線索。曲霉（Aspergillusoryzae）具有豐富的蛋白酶系,能產(chǎn)生酸性、中性和堿性蛋白酶,其穩(wěn)定性高,能耐受較高的溫度,廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)中。1.1影響米曲霉系的因素影響米曲霉酶系形成、作用的因素主要有：1．曲料：曲料米曲霉的菌絲由多細(xì)胞組成，具有產(chǎn)酶功能，菌絲體在曲料上生長(zhǎng)好壞直接關(guān)系到其酶系的形成和酶活性的強(qiáng)弱。醬油制曲過程的實(shí)質(zhì)就是要?jiǎng)?chuàng)造米曲霉生長(zhǎng)的最適宜條件，保證米曲霉充分發(fā)育繁殖，分泌出釀造醬油所需的各種酶類。所以制曲原料的選擇、處理和配比要嚴(yán)格把關(guān)。曲料要以蛋白質(zhì)含量較高、碳水化合物適量為原則進(jìn)行選擇配比。曲料的處理要注意以下幾點(diǎn)：1。粉碎要適度。顆粒太粗，會(huì)減少米曲霉生長(zhǎng)繁殖的總面積，降低酶活力；顆粒太細(xì)，潤(rùn)水后容易結(jié)塊，蒸料時(shí)會(huì)產(chǎn)生夾心，導(dǎo)致制曲通風(fēng)不暢，不利于米曲霉的生長(zhǎng)。2。蒸煮要適度。控制蛋白質(zhì)的適度變性，蛋白質(zhì)的變性過程對(duì)米曲霉生長(zhǎng)極其重要。...2．溫度醬油發(fā)酵的過程就是各種酶促反應(yīng)的過程，溫度越高，酶促反應(yīng)越快，發(fā)酵周期越短。然而，酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，它具有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性，一般在低溫時(shí)就開始受到破壞，并隨著溫度的升高，酶受到的破壞程度變大。3.PH值：PH對(duì)酶的影響主要有：（1）影響酶的穩(wěn)定性；（2）影響酶與底物的結(jié)合以及酶催化底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。在一定的條件下，各種酶都有其特定的最適PH值。偏離這個(gè)值，酶的活性都會(huì)降低，甚至?xí)鹈傅鞍踪|(zhì)的變性而失去活性。4．食鹽：食鹽對(duì)酶促反應(yīng)的影響在醬油發(fā)酵過程中，添加適量的食鹽能夠有效地抑制一些有害微生物的生長(zhǎng)和繁殖，對(duì)醬培起著防腐作用。食鹽對(duì)蛋白酶活性的影響：低質(zhì)量濃度的食鹽對(duì)蛋白酶有激活作用，反之對(duì)蛋白酶產(chǎn)生抑制作用，所以發(fā)酵狀態(tài)對(duì)酶促反應(yīng)的影響采用低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝，由于醬醅內(nèi)部粘性大、流動(dòng)性差，保溫時(shí)底部和周壁的溫度較高，酶的失活加速，很不利于酶作用的發(fā)揮醬油生產(chǎn)中的米曲霉：醬油釀造過程主要依賴于米曲霉所產(chǎn)生的豐富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多種酶系,未分解原料中的多種成分,從而形成醬油獨(dú)特的色、香、味、體。培養(yǎng)米曲霉菌種—挑選原料——煮豆——-制曲——發(fā)酵——壓榨——配置醬油——罐裝——檢測(cè)生產(chǎn)過程中需用到米曲霉的是制曲和發(fā)酵，制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生長(zhǎng)發(fā)育，并大量產(chǎn)生和積蓄所需要的酶，如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。在發(fā)酵過程中味的形成是利用這些酶的作用。如蛋白酶及肽酶將蛋白質(zhì)水解為氨基酸，產(chǎn)生鮮味；谷氨酰胺酶把萬分中無味的谷氨酰胺變成具有鮮味的俗谷氨酸；淀粉酶將淀份水解成糖，產(chǎn)生甜味；果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等能將細(xì)胞壁完全破裂，使蛋白酶和淀粉酶水解等更徹底。制成的醬曲移入發(fā)酵池或發(fā)酵罐，再加鹽水發(fā)酵。發(fā)酵是一個(gè)生物轉(zhuǎn)化過程,通過溫度和時(shí)間,讓米曲霉分泌多種酶,其中是蛋白酶和淀粉酶、蛋白酶分解蛋白質(zhì)為氨基酸,淀粉酶把淀粉分解成葡萄糖。米曲霉發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用米曲霉發(fā)酵產(chǎn)各種酶制劑發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶及應(yīng)用米曲霉在食品釀造方面的應(yīng)用歷史悠久,近些年在飼料加工方面的研究也日趨深入,這些方面的研究主要集中在米曲霉發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶方面上。最近有文獻(xiàn)報(bào)道,米曲霉發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶可以水解鱈魚粉制備蛋白胨。蛋白胨廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、醫(yī)藥、衛(wèi)生、臨床細(xì)菌檢驗(yàn)及科研等方面。可見蛋白酶在產(chǎn)品深加工領(lǐng)域也將會(huì)創(chuàng)造更大效益。發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶及應(yīng)用淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括a-淀粉酶、B-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。淀粉酶是一種誘導(dǎo)酶,這類酶的形成只有在底物存在時(shí)才能生成,其作用是將淀粉或糖漿中殘留的淀粉進(jìn)一步徹底降解為單糖即葡萄糖、果糖等。單糖對(duì)產(chǎn)品的色、香、味、體都有重要影響。2.1.3發(fā)酵產(chǎn)B-半乳糖苷酶及應(yīng)用B-半乳糖苷酶可消除乳糖不耐癥,米曲霉所代謝出的B-半乳糖苷酶能夠水解牛乳和乳清中的乳糖，成為可以吸收和甜味品質(zhì)好的半乳糖和葡萄糖。同時(shí)又能合成低聚半乳糖，此糖是雙岐桿菌增值因子,難以被人體消化,能改善便秘,具降低血糖,促進(jìn)鈣的吸收,抗齲齒等作用［6］。發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶及應(yīng)用脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑品種之一,可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng),將脂肪分解成脂肪酸和甘油并廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。不同來源的脂肪酶具有不同的催化特點(diǎn)和催化活力。王小花［7］等人對(duì)米曲霉產(chǎn)胞外脂肪酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,篩選出麥芽糖為最佳碳源,蛋白胨為最佳氮源,平高級(jí)脂肪醇與環(huán)氧乙烷加成物為最佳的表面活性劑,為米曲霉產(chǎn)脂肪酶方向的研究提供了參考。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶及應(yīng)用纖維素酶系一般包括三種水解酶，即內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)、外切葡聚糖酶(C1)、B-葡萄糖苷酶(BG)。纖維素酶在食品、飼料、農(nóng)副產(chǎn)品加工、石油開采和資源再利用等方面具有廣泛應(yīng)用前景。黃曉東［8］等人利用豆渣對(duì)米曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵得出:提取物的抗氧化性增強(qiáng)。經(jīng)分析驗(yàn)證,米曲霉代謝所產(chǎn)生的B-葡萄糖苷酶(BG)使豆渣中異黃酮糖苷酶酶解為異黃酮苷元。異黃酮苷元具有很強(qiáng)的抗氧化性。發(fā)酵產(chǎn)果膠酶及應(yīng)用果膠酶是分解果膠的酶的通稱,也是一個(gè)多酶復(fù)合物。果膠酶主要是由果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠酸鹽裂解酶和果膠酯酶組成。果膠酶可以降低果汁的粘度、澄清果汁、提高果汁超濾通量、提高葡萄酒得率及過濾速度,其應(yīng)用對(duì)食品加工業(yè)做出了很大貢獻(xiàn)。湯鳴強(qiáng)［9］等對(duì)米曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶進(jìn)行研究，得出米曲霉菌株F-81發(fā)酵條件及浸提條件。發(fā)酵產(chǎn)氨基?；讣皯?yīng)用氨基?；甘且活惸軐Ｒ凰釴-乙酰-DL-氨基酸的酰胺鍵的酶，由于這種立體專一性，所以很早就被用來拆分DL-氨基酸。L-型、D-型氨基發(fā)酵產(chǎn)植酸酶及應(yīng)用目前植酸酶在飼料添加劑市場(chǎng)需求很廣?？梢蕴岣咔萑?、禽蛋的氮、磷、鈣利用率。陳惠［11］等人對(duì)微生物產(chǎn)植酸酶的條件及熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究,對(duì)比了黑曲霉9701、米曲霉9712、根霉9702三種霉菌的固體培養(yǎng)法生產(chǎn)植酸酶的條件。由文獻(xiàn)是對(duì)比研究,所以要單向研究米曲霉,可參考此法進(jìn)行深入研究。發(fā)酵產(chǎn)大豆異黃酮糖苷酶及應(yīng)用大豆異黃酮以游離甙元和結(jié)合型的糖苷形式存在,前者生理活性很好,后者必須轉(zhuǎn)化為甙元的形式才能更好的被吸收。大豆異黃酮有抗腫瘤作用,尤其是對(duì)與激素有關(guān)的腫瘤,如乳腺癌和前列腺癌有顯著抑制作用,另外對(duì)治療和預(yù)防心腦血管疾病有很好的療效。但大多數(shù)大豆異黃酮都是以結(jié)合型糖苷形式存在,所以用米曲發(fā)酵產(chǎn)分解糖苷的酶的研究具有社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益。曾瑩［12］等人研究并優(yōu)化了米曲霉高產(chǎn)大豆異黃酮糖苷酶發(fā)酵條件,為這一領(lǐng)域的研究實(shí)踐做出了貢獻(xiàn)。發(fā)酵產(chǎn)腺苷酸脫氨酶及應(yīng)用腺苷酸(AMP)脫氨酶是一種氨基水解酶，它能夠定量脫去腺苷酸嘌吟堿基上的氨基,生成肌苷酸(IMP)和NH3°IMP可用于生產(chǎn)藥品和強(qiáng)力味精。AMP脫氨酶是構(gòu)成嘌吟核苷酸代謝循環(huán)的3種主要酶類之一,它對(duì)維持體內(nèi)腺苷酸能荷和機(jī)體免疫力有重要作用。此外,它還是核酸酶解法生產(chǎn)呈味核苷酸(鈉鹽是新一代的核苷酸類食品鮮味增強(qiáng)劑)的重要酶類之一。國(guó)內(nèi)雖在20世紀(jì)80和90年代對(duì)曲霉AMP脫氨酶進(jìn)行了研究，但目前尚未工業(yè)化生產(chǎn)。段作營(yíng)［13］等人通過實(shí)驗(yàn)獲得了米曲霉3.800固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)腺苷酸(AMP)脫氨酶的適宜培養(yǎng)基并對(duì)組成進(jìn)行了優(yōu)化，確定了麩曲中AMP脫氨酶的浸提條件，對(duì)其進(jìn)行了初步純化，為將來工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。2.1.11發(fā)酵產(chǎn)SI核酸酶及應(yīng)用SI核酸酶(SInuclease)是從米曲霉中分離純化的一種金屬蛋白，分子量為32kDa,是一種耐熱的酶(37~65°C)?？捎糜诜治鯠NA:RNA雜交體的結(jié)構(gòu)，去掉雙鏈核酸中突出的單鏈尾從而產(chǎn)生平末端，打開雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)莢環(huán)。Vogt［14］等人于1973年對(duì)米曲霉產(chǎn)的SI核酸酶進(jìn)行了純化和進(jìn)一步的性質(zhì)研究，至今相關(guān)的資料并不多見。2.1.12發(fā)酵產(chǎn)復(fù)合酶及應(yīng)用米曲霉菌絲體可以催化藥物合成3,4-二羥苯L-丙氨酸是一種藥物,它不僅可以選擇性的調(diào)節(jié)因神經(jīng)鞘受損后心肌膜能量代謝所產(chǎn)酶的的水平，而且還可以治療帕金森病。米曲霉UV-7可產(chǎn)酪氨酸羥化酶、酪氨酸酶和B-酪氨酸酶，這三種酶可以催化L-酪氨酸合成3,4-二羥苯L-丙氨酸，這一微生物學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)樯I(lǐng)域通往藥物域又開辟一條新徑［15］。米曲霉催化甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇1,3-丙二醇(1,3-PDO)是一種重要的化工原料，是有機(jī)合成的中間體，主要用作聚酯和聚氨酯的單體，以及溶劑、分析試劑、抗凍劑和保護(hù)劑等。苑廣志［16］等人采用以甘油為唯一碳源和以甘油與葡萄糖共同作碳源的方法從米曲霉菌AS3042和UV-48出發(fā),篩選到兩株催化甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的霉菌。生物催化法生產(chǎn)化工原料具有節(jié)能、環(huán)保、高效等特點(diǎn),成為人們研究熱點(diǎn),也為進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化打下基礎(chǔ)。米曲霉發(fā)酵產(chǎn)有機(jī)酸的研究與應(yīng)用發(fā)酵產(chǎn)曲酸曲酸是一種具有抗菌作用的有機(jī)酸,對(duì)水果、蔬菜有護(hù)色作用,還可以消除人體內(nèi)自由基,同時(shí)具有抑制黑色素生成酶活性的能力,還可用作攝影、膠片去斑劑等,因此在食品、化妝品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工等行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。董靜［17］等人研究了復(fù)合誘變對(duì)米曲霉2336產(chǎn)酸量的影響，經(jīng)過紫外線、60Co誘變篩選出1株不產(chǎn)黃曲霉毒素且高產(chǎn)曲酸、能利用玉米淀粉為碳源的變異株。發(fā)酵產(chǎn)圓弧偶氮酸圓弧偶氮酸是一種神經(jīng)毒。趙珊［18］等人利用反相高效液相色譜法分析米曲霉發(fā)酵液中的圓弧偶氮酸。該方法為米曲霉代謝產(chǎn)物研究開辟新徑。30總第350期中國(guó)調(diào)味品霉作為牲畜的益生素益生素是一種含有大量有益菌及其代謝產(chǎn)物和生長(zhǎng)促進(jìn)因子的活菌制劑，它能維持腸道微生物平衡、提高機(jī)體健康水平。1994年我國(guó)批準(zhǔn)了6種益生菌菌株可以使用，其中包括米曲霉(其余5種為芽孢桿菌、乳酸桿菌、糞鏈球菌、酵母菌和黑曲霉)。米曲霉及其提取物對(duì)牲畜、家禽的消化功能、生產(chǎn)功能都有很大影響。孫安權(quán)［19］等人研究了米曲霉提取物對(duì)瘤胃生態(tài)及奶牛生產(chǎn)性能的影響。瘤胃是反芻動(dòng)物的一種特殊的消化器官,在消化過程中起到很重要的作用。此項(xiàng)研究表明，米曲霉發(fā)酵提取物艾美福(Amaferm)通過刺激纖維素分解菌的生長(zhǎng)，提高纖維素酶的產(chǎn)量,提高飼草中纖維的消化率,改善反芻動(dòng)物瘤胃生理功能,穩(wěn)定瘤胃pH值,從而達(dá)到降低奶牛代謝疾病，提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能及體況，顯著提高奶?？篃釕?yīng)激的能力。Han等人(1999)通過對(duì)產(chǎn)蛋雞飼喂米曲霉益生素的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論:不能排除外源性米曲霉在胃腸道中與內(nèi)源性菌群有協(xié)同互作的作用。Grimes等(1997)進(jìn)行了一項(xiàng)試驗(yàn)，以測(cè)定米曲霉和黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物Fermacto"福美多"對(duì)產(chǎn)蛋母雞的功效。Fermacto是我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)進(jìn)口美國(guó)培一埃公司生產(chǎn)的益生素飼料添加劑。試驗(yàn)結(jié)果表明，向產(chǎn)蛋母雞日糧中添加0.1%的米曲霉益生素可以影響營(yíng)養(yǎng)元素消化、調(diào)節(jié)膽固醇代謝及腸道菌群，并減少氨氣的產(chǎn)生。3研究結(jié)果以米曲霉A-29菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)酶菌株的篩選。研究結(jié)果表明，米曲霉A-29在豆米粉7.5%、(NH4)2S040.8%、水40%、KH2P040.25%、麩皮51.45%的固體培養(yǎng)基上產(chǎn)酸性蛋白酶活力最高，發(fā)酵溫度為30°C，最適發(fā)酵時(shí)間為72h。酸性蛋白酶是一種適合在酸性條件下水解蛋白質(zhì)為小肽和氨基酸的酶類。酸性蛋白酶的條件：、pH值適應(yīng)性酸性蛋白酶作用的最適穩(wěn)定pH范圍在2.0?4.0之間，最適pH3.0,低于2.0，高于4.0將影響水解速度。曲霉屬一般在3.0以下。、溫度適應(yīng)性 酸性蛋白酶一般在50°C以下可保持穩(wěn)定，曲霉屬所產(chǎn)的酶在50°C仍穩(wěn)定，但在55C處理10分鐘就失活。、金屬離子對(duì)酶活力地影響酸性蛋白酶可被Mn2+、Ca2+、Mg2+離子激活，被Cu2+、Hg2+、Al2+離子抑制，液體酸性蛋白酶，長(zhǎng)時(shí)間存放碳鋼罐中將失活較多。4.材料及儀器材料和試劑培養(yǎng)基：麥芽汁斜面培養(yǎng)基：取已制備好的麥芽汁，調(diào)糖度為8%,加2%瓊脂，PH自然，融化后分裝試管，121C，高溫蒸汽滅菌20分鐘，制成斜面培養(yǎng)基。優(yōu)化出的酸性蛋白酶最佳正交培養(yǎng)基：豆米粉7.5%、(NH4)2S040.8%、水40%、KH2P040.25%、麩皮51.45%。菌種：米曲霉A-29,保存菌株的培養(yǎng)基為麥芽汁斜面培養(yǎng)基。發(fā)酵方法菌株的轉(zhuǎn)接將米曲霉A-29在無菌操作條件下使用接種環(huán)接入斜面培養(yǎng)基中，并置于恒溫培養(yǎng)箱中29C培養(yǎng)96h，使之全部抱子化后取出備用。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)在500ml三角瓶中裝入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，玻璃棒攪勻后，121C下滅菌20分鐘，冷卻后在超凈工作臺(tái)上將轉(zhuǎn)忠后的菌株孢子接入裝有固態(tài)培養(yǎng)基的三角瓶中，每個(gè)培養(yǎng)基接2?3環(huán)抱子，混勻。然后置于恒溫培養(yǎng)箱中29°C培養(yǎng)72h.分析方法酶的提取稱取發(fā)酵后的培養(yǎng)物2.0g，用80ml緩沖液在研缽中搗碎充分溶解，然后將混合液經(jīng)濾紙過濾，取濾液5ml加蒸餾水定容至100ml，既得稀釋800倍的待測(cè)酶液。酸性蛋白酶酶活的測(cè)定先將酪素液放入40±0.2C恒溫水浴中預(yù)熱5分鐘測(cè)定：在試樣管中，取經(jīng)40±0.2C預(yù)熱2分鐘的稀釋酶液1.0ml，加入預(yù)熱的10g/l酪素溶液1.0ml，于40±0.2C保溫10分鐘，立即加入0.4mol/l的三氯乙酸溶液2.0ml以終止反應(yīng)。在空白對(duì)照管中，取經(jīng)40±0.2C預(yù)熱2分鐘的稀釋酶液1.0ml，先加入0.4mol/l的三氯乙酸溶液2.0ml，于40±0.2C保溫10分鐘，再加入預(yù)熱的10g/l酪素溶液1.0ml。將上述的試樣管和空白對(duì)照管取出靜止10分鐘后過濾，取1.0ml濾液，加入0.4mol/l碳酸鈉溶液5.0ml，再加福林試劑1.0ml，40±0.2C水浴中顯色20分鐘取出，冷卻后在680nm處測(cè)定吸光度。酸性蛋白酶酶活的計(jì)算酸性蛋白酶酶活的定義：1g固體發(fā)酵產(chǎn)物，在乳酸緩沖液中，于40C的條件下，一分鐘分解酪蛋白產(chǎn)生一微克的酪氨酸稱為一個(gè)酶活單位，以U/g表示。計(jì)算公式：X=AXKXv/tXn=2/5XAXKXnX:樣品酶活力A：樣品平行實(shí)驗(yàn)平均吸光度K：吸光常數(shù)v：反應(yīng)體積（本實(shí)驗(yàn)v=4）t二反應(yīng)時(shí)間（本實(shí)驗(yàn)t=10）n：稀釋倍數(shù)注：平行誤差不超過3%，并且本實(shí)驗(yàn)中如果沒有特殊說明，菌體的重量都是指發(fā)酵后的菌體濕重。4.4結(jié)果與討論通過查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，麩皮、豆餅粉以及微量的無機(jī)鹽是米曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶培養(yǎng)基所必需的，因此選取3個(gè)配方，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，以考查米曲霉A-29菌株的生長(zhǎng)性能以及產(chǎn)酸性蛋白酶能力。麩皮48%，豆餅粉49.9%,磷酸二氫鉀0.10%，硫酸銨2%，固體：水=10:9麩皮73%，豆餅粉24.7%,磷酸二氫鉀0.30%，硫酸銨2%，固體：水=10:9麩皮78%，豆餅粉19.8%，磷酸二氫鉀0.20%，硫酸銨2%，固體：水=10:9研究結(jié)果表明，米曲霉A-29菌株在①號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，且菌株的抱子化程度不高，產(chǎn)酶水平較低；②號(hào)培養(yǎng)基菌株生長(zhǎng)情況與①號(hào)相似但菌株總量較大，酶活力水平提高不大；③號(hào)培養(yǎng)基的菌株生長(zhǎng)情況良好，菌株抱子化程度較好，酶酶活力水平很高。因此以③號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。4.5a.米曲霉A-29固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化在基礎(chǔ)培養(yǎng)基③中，選取豆餅粉（A）、（NH4）2S04（B）、KH2P04（C）、水（D）等4個(gè)因素，按表所示的因素水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如下：

培養(yǎng)基配比正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果/%序號(hào)ABCD酸性蛋白酶活16.750.604012963.0626.750.80.1255013863.7236.751.00.256012577.0647.500.60.1256014571.3857.500.80.254017273.3667.501.005013735.0678.250.60.255013445.5688.250.806012416.2398.251.00.1254012609.23由表可見，實(shí)驗(yàn)組5的酸性蛋白酶酶活有最大值17273.36u/g,實(shí)驗(yàn)組8的酸性蛋白酶酶活有最小值12416.23u/g,實(shí)驗(yàn)組4的蛋白酶酶活達(dá)到14571.38u/g，其他組合酸性蛋白酶酶活均幾乎在13000?14000u/g之間。ABCDX113134.6113660.0013038.1214281.88X215193.2714517.7713681.4413681.45X312823.6712973.7814431.9913188.22R2369.601543.991393.871093.66經(jīng)比較極差R,可見RA>RB>RC>RD,即實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的因素中，豆餅粉對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶水平的影響大，水的影響最小。得到酸性蛋白酶生產(chǎn)最佳因素組合為序號(hào)5，即最適培養(yǎng)及配比（％）為：豆餅粉7.5、（NH4）2S040.8、水40、KH2P040.25、麩皮51.45。豆餅粉對(duì)米曲霉A-29產(chǎn)酸性蛋白酶的影響經(jīng)數(shù)據(jù)分析，酸性蛋白酶的酶活水平隨著培養(yǎng)基中豆餅粉的增加呈“鐘”型分布,當(dāng)豆餅粉量過低或過高時(shí)都不利于酸性蛋白酶的生產(chǎn)。（NH4）2S04對(duì)米曲霉A-29產(chǎn)酸性蛋白酶的影響（NH4）2SO4可作為發(fā)酵中的無機(jī)氮源，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，濃度在2時(shí)，最適酸性蛋白酶的生產(chǎn)。其原因可能是由于濃度過高會(huì)使培養(yǎng)基的pH太低，而濃度過低則不能保證菌株正常的氮源需求所致。KH2PO4對(duì)米曲霉A-29產(chǎn)酸性蛋白酶的影響根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，磷酸鹽對(duì)蛋白酶的生產(chǎn)很重要，它具有穩(wěn)定蛋白酶的功能。分析表可知，磷酸鹽在0.25%時(shí)，即水平3時(shí)最適合酸性蛋白酶的生產(chǎn)。這一結(jié)果也再次證明磷酸鹽具有穩(wěn)定蛋白酶的功能。水量對(duì)米曲霉A-29產(chǎn)酸性蛋白酶的影響固體發(fā)酵的特點(diǎn)在于，它是在培養(yǎng)基呈固態(tài)，雖然含水豐富，但沒有或幾乎沒有自由流動(dòng)水的狀態(tài)下進(jìn)行的一種或多種微生物發(fā)酵過程。隨著培養(yǎng)基中水量的增加，米曲霉的產(chǎn)酶水平是呈逐漸降低的趨勢(shì)，可見該發(fā)酵過程過量水的加入將對(duì)酸性蛋白酶的產(chǎn)生有一定抑制作用。這也許主要是因?yàn)殡S著水的加入，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中更容易結(jié)塊，培養(yǎng)基緊密度的增加，將使米曲霉生長(zhǎng)時(shí)的透氣性較低，對(duì)米曲霉的生長(zhǎng)造成了抑制，因而影響產(chǎn)酶能力。b.米曲霉A-29固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化①．培養(yǎng)時(shí)間的影響考察米曲霉A-29在29°C分別培養(yǎng)24?84h米曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶的情況，其產(chǎn)酶結(jié)果如表所示，可看出29C下進(jìn)行發(fā)酵，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，酸性蛋白酶的生產(chǎn)呈現(xiàn)直線增加趨勢(shì)，但在72h達(dá)到最大值，最大值為17337.69U/g，超過72h后發(fā)酵產(chǎn)物的酶活逐漸下降。這主要是由于米曲霉A-29在產(chǎn)酸性蛋白酶的同時(shí)，酸性蛋白酶也在失去活性，當(dāng)發(fā)酵所產(chǎn)生的酶與同時(shí)被分解失活的酶量差值最大時(shí)，所測(cè)酶活將出現(xiàn)最大值，即72h時(shí)。當(dāng)超過72h后，由于菌體的孢子化程度加強(qiáng)，產(chǎn)酸性蛋白酶的能力相應(yīng)降低，但酸性蛋白酶的分解率沒有發(fā)生變化，因而其酸性蛋白酶酶活逐漸降低。時(shí)間/h1234平均吸光度平均酶活/u.g-1240.1150.1520.1430.1230.1334278.13360.2580.3050.2660.2240.2638459.76480.3710.3260.3250.3280.33810872.24

600.5080.4420.4320.5040.47215182.54720.5610.5240.5520.5170.53917337.69840.4740.4870.4780.5020.48515600.70②．培養(yǎng)溫度的影響由圖可知，30°C下培養(yǎng)的產(chǎn)物的酸性蛋白酶酶活最高，27°C下培養(yǎng)的產(chǎn)物的酶活與33°C下培養(yǎng)的產(chǎn)物的酶活大致相同。因此，米曲霉A-29的最佳培養(yǎng)溫度是30°C。27C時(shí)溫度低蛋白酶的失活速率小，但同時(shí)菌體的生長(zhǎng)性能也受到了抑制。33C時(shí)溫度高，使酸性蛋白酶失活速率加快，其酶活也不會(huì)太高。30C時(shí)菌體抱子化較慢，且酸性蛋白失活速率也相對(duì)較緩慢，酸性蛋白酶的酶活就很高，因此菌株在30C時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)酶最高峰。溫度/°c1234平均吸光度平均酶活/u.g-1270.5130.4830.4140.4740.47115150.37300.5610.5240.5520.5170.53917337.69330.5080.4420.4320.5040.47215182.54結(jié)：通過正交試驗(yàn)方法，優(yōu)化得到了米曲霉A-29菌株產(chǎn)酸性蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基（％）為：豆餅粉7.5、（NH4）2S040.8、水40、KH2P040.25、麩皮51.45。通過培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出：較佳固態(tài)發(fā)酵時(shí)間為：72時(shí)。較佳培養(yǎng)溫度：30°C.1.化學(xué)成分米曲霉基本信息Aspergillusoryzae（Asp.oryzae）半知菌亞門，絲抱綱，絲抱目，從梗抱科，曲霉屬真菌中的一個(gè)常見種。結(jié)構(gòu)介紹米曲霉菌落生長(zhǎng)快,10d直徑達(dá)5~6cm，質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色。背面無色。分生抱子頭放射狀，一直徑 150~300口m，也有少數(shù)為疏松柱狀。分生抱子梗2mm左右。近頂囊處直徑可達(dá)12~25口m，壁薄，粗糙。頂囊近球形或燒瓶形，通常40~50米曲霉口m。小梗一般為單層，12~15口m，偶爾有雙層，也有單、雙層小梗同時(shí)存在于一個(gè)頂囊上。分生抱子幼時(shí)洋梨形或卵圓形，老后大多變?yōu)榍蛐位蚪蛐?，一?4.5口m,粗糙或近于光滑。 分生抱子梗長(zhǎng)約2mm，近頂囊處直徑達(dá)12?25口m,壁薄而精糙。頂囊近球形或燒瓶形，直徑40?50口m,上覆單層小梗。分生抱子幼時(shí)洋梨形或隨圓形，成熟后為球形或近球形，直徑4.5?7.0口m,表面粗糙或近于光滑。分生抱子頭直徑150?300口m。菌落生長(zhǎng)較快，質(zhì)地疏松。初呈白色、黃色，后轉(zhuǎn)黃褐色至淡綠褐色，背面無色，分布甚廣，主要在糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物和土壤等處。是我國(guó)傳統(tǒng)釀造食品醬和醬油的生產(chǎn)菌種。也可生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等。會(huì)引起糧食等工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品霉變。在生產(chǎn)上的作用米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低分子糖類，