免疫組庫(kù)測(cè)序研究知識(shí)資料文檔

IR-SEQ1行業(yè)傾力目錄免疫組庫(kù)（IR）免疫組庫(kù)測(cè)序技術(shù)信息分析2行業(yè)傾力1、免疫組庫(kù)概念免疫組庫(kù)（ImmuneRepertoire，IR）是指在任何指定時(shí)間，某個(gè)個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B細(xì)胞和T細(xì)胞的總和。研究免疫組庫(kù)就要測(cè)定免疫系統(tǒng)中的BCR和TCR的基因或RNA分子序列。影響免疫組庫(kù)組成的因素有很多種。比如年齡、疾病、免疫記憶、免疫缺陷遺傳疾病、疫苗、器官移植、癌癥治療等。3行業(yè)傾力根據(jù)淋巴細(xì)胞DNA來(lái)源的不同，對(duì)于免疫組庫(kù)的研究分為以下幾大類(lèi)：健康人士一般采用抽取外周血的方式；特殊人群比如白血病人或者白血病細(xì)胞微小殘留?。∕RD）患者，為了深入研究其免疫組庫(kù)的變化也將骨髓血作為淋巴細(xì)胞DNA的來(lái)源；剛出生的嬰兒，其臍帶血可以用于研究人在出生早期與母親在免疫組庫(kù)方面的聯(lián)系與區(qū)別；而對(duì)于動(dòng)物來(lái)說(shuō)尤其是小型動(dòng)物，脾臟也是常見(jiàn)淋巴細(xì)胞的DNA來(lái)源臟器。以唾液和尿液作為淋巴細(xì)胞DNA來(lái)源的方式。

4行業(yè)傾力2、BCRB細(xì)胞受體（BCR）又稱(chēng)為免疫球蛋白（IG），它是由B細(xì)胞分泌的可以和抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)分子。成熟的B細(xì)胞可以將IG分泌到細(xì)胞外面以中和抗原。免疫球蛋白由兩條重鏈（heavychain,H），兩條輕鏈（lightchain,L）中間通過(guò)二硫鍵連接而成。重鏈（IGH）由Variable（V），Diversity（D），Joining（J）和Constant（C）基因片段重組而來(lái)；輕鏈（IGL）只由V-J-C重組而來(lái)。重鏈（H鏈）又分為V區(qū)、C區(qū)、跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)；而輕鏈（L鏈）則只有V區(qū)和C區(qū)。V區(qū)由VH和VL兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，各有3個(gè)CDR即CDR1、CDR2和CDR3。5行業(yè)傾力決定B淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原的關(guān)鍵部位是最具多樣性的重鏈CDR3區(qū)，其多樣性的產(chǎn)生源于IGHV（51個(gè)功能性基因片段）末端-IGHD(23個(gè)功能性基因片段）-IGHJ前端（6個(gè)功能性基因片段）基因重排及V-D和D-J連接時(shí)非模板依賴(lài)性核苷酸插入或剪切和體細(xì)胞高頻突變等。6行業(yè)傾力3、TCRT細(xì)胞受（TCR）是由T細(xì)胞分泌的膜蛋白分子，與BCR不同的是TCR只在細(xì)胞表面而不分泌出去。一個(gè)T細(xì)胞的TCR可以是α鏈和β鏈組成的，或者由γ鏈和δ鏈組成的。α鏈和γ鏈由V-J-C基因片段重組而來(lái)，β鏈和δ鏈由V-D-J-C基因片段重組而來(lái)，這也類(lèi)似于BCR的重鏈和輕鏈。參與特異性免疫應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞主要是α/βT淋巴細(xì)胞，占外周Ｔ淋巴細(xì)胞的90-95%。TCRβ鏈CDR3在抗原特異性識(shí)別中起關(guān)鍵作用，是直接與抗原肽的結(jié)合位點(diǎn)，其編碼基因位于人類(lèi)7號(hào)染色體（7q34），全長(zhǎng)620kb，由50多個(gè)可變區(qū)（V區(qū)）基因片段、2組上游D基因片段/下游恒定區(qū)（C區(qū)）基因片段、6~7個(gè)J區(qū)基因片段組成，這些基因在T淋巴細(xì)胞發(fā)育早期不連續(xù)分布，在胸腺內(nèi)原始T細(xì)胞階段，D-J區(qū)片段連接為DJ片段；在成熟T淋巴細(xì)胞階段，V、D、J、C區(qū)基因片段相連成VDJC片段。7行業(yè)傾力據(jù)推測(cè)，胚系VDJC基因片段隨機(jī)組合、重排以及TCRα/β鏈和γ/δ鏈V區(qū)基因重排產(chǎn)生的TCR克隆數(shù)量高達(dá)1015-1018，構(gòu)成多樣性極其豐富的T淋巴細(xì)胞抗原受體庫(kù)。不同T淋巴細(xì)胞克隆有不同序列或長(zhǎng)度的TCR-CDR3基因，翻譯出不同的CDR3多肽序列，從而反映T淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)。在發(fā)生特異性免疫應(yīng)答時(shí)，TCR多樣性發(fā)生變化，出現(xiàn)寡克隆甚至單克隆擴(kuò)增，隨著胸腺再生，大量原始T淋巴細(xì)胞增殖，TCR免疫組庫(kù)多樣性得以恢復(fù)和重建。8行業(yè)傾力不同VDJ基因片段組合的多樣化；不同基因片段連接時(shí)隨機(jī)插入刪除造成連接的多樣化，V(D)J連接區(qū)核苷酸的插入和刪除，體現(xiàn)為互補(bǔ)決定區(qū)簇CDR3)序列多樣性；不同重鏈和輕鏈組合的多樣化；以及B細(xì)胞受體特有的隨機(jī)高頻突變。4、BCR/TCR多樣性產(chǎn)生機(jī)制

9行業(yè)傾力5、研究免疫組庫(kù)的流程提取樣本DNA/RNA:根據(jù)所要研究的問(wèn)題設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，提取血液或組織樣本，分離B細(xì)胞或T細(xì)胞，然后提取和純化DNA/RNA。構(gòu)建測(cè)序文庫(kù):根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)情況加入不同擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而擴(kuò)增出想要測(cè)序的免疫基因，最后構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序:利用二代高通量測(cè)序儀，如Roche454、IlluminaHiSeq2500、IlluminaMiSeq等進(jìn)行測(cè)序。信息分析:對(duì)測(cè)出來(lái)的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行信息挖掘，來(lái)發(fā)掘出生物學(xué)意義與結(jié)果。數(shù)據(jù)分析主要包括數(shù)據(jù)清理、質(zhì)量控制、不同樣本數(shù)據(jù)分離、序列比對(duì)、序列注釋以及下游的各種分析。10行業(yè)傾力11行業(yè)傾力二、免疫組庫(kù)測(cè)序12行業(yè)傾力1、免疫組庫(kù)測(cè)序概念免疫組庫(kù)測(cè)序（ImmuneRepertoiresequencing(IR-SEQ)）是以T/B淋巴細(xì)胞為研究目標(biāo)，用多重PCR技術(shù)或5’RACE擴(kuò)增決定B細(xì)胞受體（BCR）或T細(xì)胞受體（TCR）多樣性的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR3區(qū)），再結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)（HTS），全面評(píng)估免疫系統(tǒng)的多樣性，深入挖掘免疫組庫(kù)與疾病的關(guān)系。13行業(yè)傾力2、兩種PCR技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)14行業(yè)傾力Arm-PCR是最新開(kāi)創(chuàng)的一種高效擴(kuò)增子救援多重PCR，它克服了傳統(tǒng)多重PCR的缺限。通過(guò)在擴(kuò)增的早期使用基因靶點(diǎn)特異性的引物，而在指數(shù)擴(kuò)增期使用共用的引物，使得所有模板的擴(kuò)增效率大大提高，因而具有較高的特異性和靈敏性。15行業(yè)傾力3、模板比較基因組雖然DNA容易制備，但PCR擴(kuò)增過(guò)程中易產(chǎn)生非產(chǎn)出性的重組序列，且J-C區(qū)之間存在的大量?jī)?nèi)含子使其下游引物只能位于J區(qū)，PCR擴(kuò)增的敏感性一般由細(xì)胞的拷貝量決定；相對(duì)而言，RNA需取自新鮮的標(biāo)本，其產(chǎn)物多為產(chǎn)出性的CDR3序列，下游引物可選自C區(qū)，具有高度的敏感性。16行業(yè)傾力4、主流測(cè)序技術(shù)及優(yōu)缺點(diǎn)17行業(yè)傾力

免疫組庫(kù)分析的精確性依賴(lài)于HTS數(shù)據(jù)的可靠性。而HTS數(shù)據(jù)的可靠性又依賴(lài)于測(cè)序的準(zhǔn)確性和覆蓋的深度。18行業(yè)傾力Thermo測(cè)序平臺(tái)IonTorrent:革新性的半導(dǎo)體芯片測(cè)序技術(shù)平臺(tái)原理是：向DNA聚合物中加入dNTP，會(huì)釋放出氫離子。我們采用半導(dǎo)體測(cè)定這些氫離子引起的pH變化，通過(guò)同時(shí)測(cè)量數(shù)百萬(wàn)起此類(lèi)變化，可以測(cè)定各個(gè)片段的序列。高效靶向覆蓋-運(yùn)用多重PCR設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)平均97%靶向覆蓋讀長(zhǎng)-可選擇200bp或400bp讀長(zhǎng)19行業(yè)傾力5、信息分析1、基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)過(guò)濾，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭污染序列及低質(zhì)量reads的處理

數(shù)據(jù)搭建，數(shù)據(jù)拼接，消除測(cè)序背景及有效數(shù)據(jù)構(gòu)建

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測(cè)序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評(píng)估2、數(shù)據(jù)比對(duì)分析

比對(duì)分析，與數(shù)據(jù)庫(kù)（IMGT）V/D/J基因片段比對(duì)

重新比對(duì)，尋找最佳V/D/J比對(duì)結(jié)果3、序列結(jié)構(gòu)分析

分析CDR序列組成及序列堿基成分

分析CDR序列的堿基插入和缺失

編碼CDR序列翻譯成氨基酸和肽鏈20行業(yè)傾力4、免疫組庫(kù)構(gòu)建

構(gòu)建免疫組庫(kù)表達(dá)譜，統(tǒng)計(jì)多樣性抗體庫(kù)克隆表達(dá)情況

免疫組庫(kù)多樣性呈現(xiàn)，繪制V/J基因表達(dá)的2D、3D圖5、免疫組庫(kù)差異分析

樣品間多樣性差異分析（辛普森系數(shù)、香農(nóng)威納系數(shù)）

樣品間克隆表達(dá)差異分析（CDR3，V-D-J）

分組樣品間的克隆表達(dá)差異分析（CDR3，V-D-J）21行業(yè)傾力6、IR-SEQ存在的問(wèn)題1、構(gòu)建免疫組庫(kù)的過(guò)程實(shí)際上是基于多重引物PCR來(lái)覆蓋BCR或TCR序列多樣性的過(guò)程，這就會(huì)涉及多重引物之間擴(kuò)增效率導(dǎo)致的偏好性的問(wèn)題，一套好的多重引物總會(huì)平衡各對(duì)引物之間的擴(kuò)增效率以及盡量避免引物間的非特異性擴(kuò)增和二（多）聚體，可以說(shuō)構(gòu)建的免疫組庫(kù)質(zhì)量的好壞直接取決于其多重引物質(zhì)量的高低。22行業(yè)傾力2、以人體內(nèi)BCR為例，保守估計(jì)BCR的種類(lèi)多樣性在1011這一數(shù)量級(jí)級(jí)別上，其中骨髓方面占17%，全身淋巴結(jié)占到28%，脾臟和粘膜系統(tǒng)占23%，外周血方面僅占2%，其他約占30%。然而我們對(duì)人免疫組庫(kù)的研究往往是以來(lái)源方便的外周血，顯然外周血對(duì)免疫組庫(kù)多樣性的貢獻(xiàn)率2%遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，為了能盡量完全地反映人群的免疫組庫(kù)全貌