nf單抗環(huán)七肽庫的篩選及氨基酸序列分析

nf單抗環(huán)七肽庫的篩選及氨基酸序列分析

眾所周知，tnf-是多種疾?。ㄈ鐢⊙孕菘?、移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病）的病理過程中的一個(gè)重要因素。它也在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和肝炎等慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。由此可見,在許多情況下,其病理損傷作用更甚于其生理作用。因此,TNF-α拮抗藥物或制劑的研制、開發(fā)與應(yīng)用日益受到重視。對TNF-α的研究發(fā)現(xiàn),其生物學(xué)活性的發(fā)揮是通過與相應(yīng)的相對分子質(zhì)量(Mr)為55000和75000的受體相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步對可溶性人的Mr為55000的受體與TNF-α結(jié)合形成的復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),TNF-α與其受體相互結(jié)合時(shí),兩者之間具有較大面積的接觸面,但其中受體胞外區(qū)只有3個(gè)短肽序列,即關(guān)鍵性殘基在與相應(yīng)的TNF-α基團(tuán)的結(jié)合中發(fā)揮著重要的作用。這一發(fā)現(xiàn)提示,篩選設(shè)計(jì)能夠模擬TNF-α表位的小分子藥物先導(dǎo)化合物具有潛在的可能性。小分子肽類藥物具有易合成、可給予高濃度及口服等優(yōu)點(diǎn),相對于大分子的TNF-α拮抗劑所存在的表達(dá)量低、純化較難及價(jià)格過高等問題,具有更加廣闊的應(yīng)用前景。我們利用1株具有中和活性的抗TNF-α單克隆抗體(mAb)J1D9為釣餌,來篩選噬菌體環(huán)七肽庫,旨在獲得可模擬TNF-α表位的短肽,為研究模擬TNF-α表位的小分子藥物先導(dǎo)化合物提供理論依據(jù)和技術(shù)借鑒。1材料和方法1.1gcgtaag-3噬菌體環(huán)七肽庫(庫容2×1016pfu/L)、受體菌ER2738及測序引物5′-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′,均購自NewEnglandBiolabs公司?？筎NF-αmAbJ1D9為LABvision公司產(chǎn)品。重組TNF-α(100mg/L)為PeproTechec公司產(chǎn)品。HRP-抗M13mAb為Pharmacia產(chǎn)品。乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為武漢同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫教研室惠贈。CHO細(xì)胞為本教研室提供。1.2方法1.2.1噬菌體mab制備mAb對噬菌體環(huán)七肽庫的篩選以抗TNF-αmAb(100mg/L)包被ELISA板,100μL/孔,4℃過夜孵育。用30g/LBSA于37℃封閉2h,1mL/LTween20-TBS(TBST)洗板5次,加入5μL噬菌體環(huán)七肽庫和95μLTBS,室溫緩慢振蕩1h。用1mL/LTBST洗板15次,洗去未結(jié)合的及低親和力結(jié)合的噬菌體。加入100μL0.2mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.2),室溫溫和震蕩10min,洗脫結(jié)合于固相化表面的抗TNF-αmAb噬菌體。以此噬菌體侵染宿主菌ER2738,測定滴度、擴(kuò)增后,用于第2輪篩選。第2、3輪篩選時(shí),將包被mAb的濃度減為10mg/L及1mg/L,加入前一輪擴(kuò)增純化的噬菌體5μL,洗滌液為5mL/LTBST。同第1輪洗滌、洗脫,測定滴度,并在第3輪的IPTG/Xgal瓊脂板上,挑取單個(gè)噬菌體斑制備噬菌體原種進(jìn)行抗原性鑒定。1.2.2噬菌體的純化①雙mAb夾心ELISA:以1mg/L抗TNF-αmAb(50μL/孔)包被酶聯(lián)板過夜,用100g/L脫脂奶粉37℃封閉1h,5mL/LTBST洗板5次。依次加50μL噬菌體原種(37℃作用1h,TBST洗板)及1∶5000HRP-抗M13mAb(37℃1h)。最后以O(shè)PD底物顯色2min,用2mol/L硫酸終止反應(yīng)后,于波長490nm波長測定A值,以A值高于陰性對照3倍以上者為陽性。②噬菌體ELISA:將前述雙夾心ELISA中為陽性的9個(gè)噬菌體克隆純化,以滴度為1.0×1015pfu/L的純化噬菌體(50μL/孔)包被酶聯(lián)板,過夜。用100g/L脫脂奶粉封閉后,依次加入1mg/L抗TNF-αmAb(50μL/孔,37℃作用1h,以TBST洗板)及1∶1000HRP-兔抗鼠IgG(37℃1h),同上述夾心ELISA顯色、終止反應(yīng)、測定A值及判定陽性結(jié)果。1.2.3膜裂解物的提取MCF-7細(xì)胞膜裂解物的制備:MCF-7細(xì)胞膜上高表達(dá)TNF-α受體,用NP-40單去垢劑裂解緩沖液制備的其細(xì)胞膜裂解物中,即含有高濃度的TNF-α受體。同法提取CHO細(xì)胞的細(xì)胞膜裂解物作為對照。以1mg/L抗TNF-αmAb(50μL/孔)包被酶聯(lián)板孵育過夜。封閉、洗板后,將細(xì)胞膜裂解物按1∶40、1∶80、1∶160、1∶320及1∶640稀釋,取25μL與等量的噬菌體陽性克隆上清(1.0×1015pfu/L)混勻,室溫15～30min,加入到孔內(nèi)。孵育、洗板后,加1∶5000HRP-抗M13mAb37℃1h,以O(shè)PD底物顯色后,測定A值并計(jì)算抑制率。1.2.4rhtnf-陽性克隆以1mg/L抗TNF-αmAb(50μL/孔)包被酶聯(lián)板孵育過夜。封閉、洗板后,依次加入不同稀釋(80、8、0.8及0.08mg/L)的rhTNF-α各25μL/孔(37℃孵育30min,洗板)、噬菌體陽性克隆(1.0×1015pfu/L)25μL/孔(同上孵育及洗板),加1∶5000HRP-抗M13mAb(37℃1h)。以下步驟同1.2.3方法。1.2.5瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增的陽性噬菌體克隆以PEG/NaCl純化后,再以碘化鈉溶解抽提噬菌體單鏈DNA,并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。DNA序列的測定采用Biolabs公司提供的測序引物,由中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安公司全自動測序。2結(jié)果2.1抗體包被濃度對回收率的影響以具有中和活性的抗TNF-αmAb為靶分子,對噬菌體環(huán)七肽庫進(jìn)行了3輪篩選,在3輪篩選中,依次遞減了抗體的包被濃度,保持了投入噬菌體的量,從噬菌體的回收率看,僅有輕度富集效果(表1)。但本實(shí)驗(yàn)減少包被量的目的主要是為了得到高親和力的噬菌體,而不是高富集率。2.2噬菌體的tnf-mab與ptg/mab的結(jié)合以第3輪洗脫的噬菌體侵染宿主菌ER2738,鋪板過夜。隨機(jī)挑取IPTG/Xgal瓊脂板上的20個(gè)噬斑,制備噬菌體原種,以抗TNF-αmAb包被做夾心ELISA,鑒定噬菌體克隆是否具有與抗TNF-αmAb結(jié)合的抗原性。結(jié)果顯示,有9個(gè)克隆為陽性克隆(圖1)。2.3陽性噬菌體克隆的模擬為進(jìn)一步確證所篩選的噬菌體克隆具有可與抗TNF-αmAb結(jié)合的抗原性,挑取上述9個(gè)陽性噬菌體克隆并純化,以1.0×1016pfu/L(50μL/孔)包被酶聯(lián)板,鑒定陽性噬菌體克隆是否可模擬TNF-α表位結(jié)合抗TNF-αmAb。試驗(yàn)結(jié)果顯示,陽性克隆與抗TNF-αmAb均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性(圖2)。2.4mcf-7細(xì)胞裂解物濃度對tnf-受體抑制率的影響提取含高濃度TNF-α受體的MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞膜裂解物,阻斷陽性噬菌體克隆與抗TNF-αmAb的結(jié)合,以間接說明陽性噬菌體克隆是否可模擬TNF-α的表位與相應(yīng)受體結(jié)合。挑選前述試驗(yàn)中的7號陽性克隆定義為LCS-7(c-RRPAQSG-c),以低表達(dá)TNF-α受體的CHO細(xì)胞的細(xì)胞膜裂解物作為陰性對照,計(jì)算抑制率(圖3)。該試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著MCF-7細(xì)胞膜裂解物稀釋度的提高,對噬菌體克隆LCS-7與mAb之間結(jié)合的抑制率逐漸降低,而對照未出現(xiàn)與濃度相關(guān)的抑制作用,證明該克隆與抗TNF-αmAb的結(jié)合受到MCF-7細(xì)胞膜裂解物中TNF-α受體的抑制。即陽性克隆展示肽能夠模擬TNF-α的表位。其余兩種陽性克隆亦顯示同樣結(jié)果。2.5噬菌體tnf-表達(dá)的模擬包被抗TNF-αmAb后,先加入TNF-α與之結(jié)合,封閉mAb的結(jié)合位點(diǎn)。然后再加入陽性噬菌體克隆,以此鑒定該克隆展示肽是否可模擬TNF-α的表位(圖4)。結(jié)果顯示,隨著TNF-α濃度的逐漸降低,其阻斷噬菌體與mAb結(jié)合的作用亦隨之降低,從而與mAb結(jié)合的噬菌體克隆量逐漸增加,證明該mAb所識別的TNF-α的表位與篩選得到的噬菌體展示肽所模擬的表位相同或相似。其余兩種陽性克隆顯示同樣的結(jié)果。2.6隆重1dna序列將上述9個(gè)陽性噬菌體克隆的DNA測序,以推測其相應(yīng)肽的序列。結(jié)果顯示,9個(gè)克隆中5個(gè)克隆的DNA序列為:AATAAGCATAATCGTAAGATT,3個(gè)為:AGGCGTCCGGCGCAGTCTGGT,1個(gè)為AGAGGCATAAGTCGTAAGATT。相對應(yīng)的氨基酸序列分別為:c-RRPA-QSG-c、c-NKHNRKI-c和c-RGMSRKI-c。3噬菌體環(huán)七肽的篩選TNF-α對許多腫瘤細(xì)胞具有抑制和殺傷作用,也是致內(nèi)毒素性休克、急性移植物抗宿主病及一些自身免疫病的重要效應(yīng)因子,因此,TNF-α的改造和TNF-α拮抗劑的研究受到各國學(xué)者的重視。重組TNF-α及其拮抗劑(包括抗TNF-αmAb、抗TNF-α受體mAb、可溶性TNF-α受體及TNF-α突變體),均已應(yīng)用于臨床并取得了一定的治療效果。但mAb的人源化、重組細(xì)胞因子或受體的純化、不同程度的抗原性及價(jià)格因素等,均成為制約上述制劑在國內(nèi)應(yīng)用的因素。相比之下,小分子肽類具有容易合成并能夠給予高濃度、可口服等優(yōu)點(diǎn),因而成為藥物研究中新的熱點(diǎn)。近年來,國外已報(bào)道了多種細(xì)胞因子小分子模擬物,并顯示出明顯的拮抗劑性質(zhì)。這些研究提示,發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化拮抗TNF-α毒副作用的小分子藥物先導(dǎo)化合物具有極大的可行性。楊子義等利用抗rhTNF-α的mAbT5,篩選15肽隨機(jī)肽庫來研究mAb所識別的模擬表位。而我們的研究則利用1株具有中和活性的抗TNF-αmAb篩選噬菌體環(huán)七肽庫。采用具有中和活性的mAb優(yōu)點(diǎn)如下:①有利于對TNF-α活性中心的研究,由于該mAb能中和TNF-α的活性,因而其結(jié)合表位也就有可能處在TNF-α分子的活性中心;②篩選得到的模擬肽序列更有可能與受體的活性部位結(jié)合,由此易成為受體的激動劑或拮抗劑;③有利于研究抗體結(jié)合TNF-α表位的CDR結(jié)構(gòu)。篩選噬菌體環(huán)七肽庫的優(yōu)勢在于:①環(huán)肽較線性肽具有一定的空間構(gòu)象,在液相中更穩(wěn)定,有利于進(jìn)一步研究TNF-α和其配基作用的空間構(gòu)象。根據(jù)以往對噬菌體肽庫的研究顯示,從構(gòu)象限制型肽庫篩選到的肽比線性隨機(jī)肽庫中得到的肽,與靶分子結(jié)合的親和力高。②構(gòu)象限制型肽庫可在空間上模擬真實(shí)的分子間的相互結(jié)合作用,有利于我們對配體-受體相互結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵性位點(diǎn)進(jìn)行研究分析。為了獲得高親和力的噬菌體短肽及提高篩選的特異性,在3輪篩選中逐次降低了靶蛋白的濃度,其目的在于獲得高親和力的克隆而非提高富集率。從篩選結(jié)果來看,篩選回收率確無明顯的富集,但所獲陽性克隆的鑒定顯示,與抗TNF-αmAb有較強(qiáng)的結(jié)合特異性,并能與rhTNF-α競爭與mAb的結(jié)合;而MCF-7細(xì)胞膜裂解物阻斷試驗(yàn)的結(jié)果則進(jìn)一步證明,陽性噬菌體克隆不僅可與篩選的靶mAb結(jié)合,亦可與人TNF-α受體分子相結(jié)合。由于篩選用的靶抗體為中和性抗體,是針對TNF-α活性部位的,因此可推斷,所篩選的表位是模擬TNF-α的活性序列,本實(shí)驗(yàn)獲得的短肽可與人TNF-α受體分子結(jié)合即是一個(gè)極具說服力的證明。此結(jié)果具有非常重要的意義,它提示該展示肽序列具備了成為模擬TNF-α生物學(xué)活性的小分子受體激動劑或拮抗劑的基本條件。本實(shí)驗(yàn)所獲陽性噬菌體克隆氨基酸序列為c-NKHNRKI-c、c-RRPAQSG-c和c-RGMSRKI-c,查找GenBank數(shù)據(jù)庫,在一級結(jié)構(gòu)上與TNF-α均不具有同源性。究其原因,在于噬菌體環(huán)七肽庫展示肽為構(gòu)象限制性環(huán)肽而非線性肽,能更好地模擬分子間結(jié)合的空間構(gòu)象,因此獲得的短肽可能是模擬TN