流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠IFN

預(yù)實(shí)驗(yàn)：流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)小鼠外周血IFN-Y和IL-4RPMI1640培養(yǎng)液佛波酯PMA、離子霉素lonomycin、莫能菌素Monensin配肝素鈉配PBS固定/透化劑（棕色瓶）BDPerm/washTMBuffer（1x）PEanti-mouseIFN-y（0.2mg/ml）PE/Cy7anti-mouseIl-4（0.2mg/mL）FITCanti-mouseCD4（0.5mg/mL）流式管+EP管紅細(xì)胞裂解液（1x）染色緩沖液1、 激活劑PMA（引起T細(xì)胞的活化）儲(chǔ)存：1mgPMA+10mlDMSO配制成0.1mg/ml，分裝20山/管，一20度。勿反復(fù)融凍。實(shí)驗(yàn)1：用無(wú)菌、無(wú)疊氮鈉PBS1：100稀釋儲(chǔ)存液，終濃度為20ng/ml。實(shí)驗(yàn)2：無(wú)菌1640稀釋成1:100的工作液，500ul全血+12.5ul工作液，終濃度為25ng/ml。2、 激活劑離子霉素Ionomycin（協(xié)同活化T細(xì)胞）儲(chǔ)存1：1mg+2ml乙醇配制成0.5mg/ml的儲(chǔ)存液，一20度。實(shí)驗(yàn)1：用無(wú)菌、無(wú)疊氮鈉PBS1：10稀釋儲(chǔ)存液，終濃度為1ug/ml。儲(chǔ)存2：1mg+2mlDMSO配制成0.5mg/ml的儲(chǔ)存液，一20度。實(shí)驗(yàn)2：用無(wú)菌1640液1：10成工作液，500ul全血+10ul工作液，終濃度為1ug/ml。，3、 阻斷劑莫能菌素（阻斷細(xì)胞因子分泌至胞外）儲(chǔ)存1：用DMSO配制成濃度為1mg/ml的儲(chǔ)存液，4°C儲(chǔ)存至少4個(gè)月實(shí)驗(yàn)1：用無(wú)菌、無(wú)疊氮鈉PBS1：10稀釋儲(chǔ)存液，終濃度為2umol/L。儲(chǔ)存2：50mg+1ml甲醇配成50mg/mlrrr實(shí)驗(yàn)2：無(wú)菌16401:500稀釋成0.1mg/ml工作液，500ul全血+8.5ul工作液，終濃度1.4ug/ml。流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血 CD4+Q紅細(xì)胞裂解液使用前放置室溫3） 取抗凝血100"加入到標(biāo)記好的流式管內(nèi)，加入以FITCRatAnti-MouseCD4（0.5mg/mL）4） 避光放置30min5） 加入紅細(xì)胞裂解液mL，輕輕吹打混勻，室溫避光反應(yīng)5min，以1500河離心5min，棄上清。（看看破紅效果如何，效果不好可重復(fù)）6） 加2mL尸85混勻后，1500rpm離心5質(zhì)瀝，棄上清。7） 細(xì)胞沉淀加入00皿郁5重懸后，流式細(xì)胞儀分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血IFN-Y、IL-4（三色）1） 眼球采血一只鼠，2mlEP管內(nèi)血量約1ml,事先加入肝素鈉溶液300ul（按照30ul肝素鈉溶液：100ul全血的比例）2） 刺激培養(yǎng)? 【CD4】【IFN-g】【IL-4】【實(shí)驗(yàn)】【空白】Ep管加入100^1全血+100^1刺激RPMI1640培養(yǎng)液（含有佛波酯PMA40ng/ml、離子霉素lonomycin2umol/L及莫能菌素Monensin1.4ul/ml三種試劑）預(yù)實(shí)驗(yàn)PMA佛波酯（1mg/ml）0.05ul（0.5ulPMA+9.5ul培養(yǎng)基取0.5ul）Ionomycin離子霉素（0.5mg/ml）4ulMonensin莫能霉素1.4ulUpto1ml?【對(duì)照】100ul全血+100ul不含刺激物的1640培養(yǎng)液于37°C、5%CO2中孵育4h,計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，手機(jī)計(jì)時(shí)每半小時(shí)輕輕顛倒混勻一次。3） 裂解紅細(xì)胞將上述液體轉(zhuǎn)移到流式管內(nèi)（200J1L），加入》濃度的紅細(xì)胞裂解液2mL（預(yù)實(shí)驗(yàn)中紅細(xì)胞裂解液采用1ml+9ml稀釋，準(zhǔn)備一個(gè)離心管），輕輕吹打混勻，室溫避光，15mins。以1500rpm離心5min，棄上清，留沉淀。每管中加A2ml染色緩沖液混合均勻，1500rpm，5min離心，棄上清，留沉淀。4） 細(xì)胞表面抗原的染色（CD4）?【CD4】【實(shí)驗(yàn)】【對(duì)照】管各加FITCanti-mouseCD4（0.5mg/mL）_^ul+染色緩沖液98ul?【IFN-g】【IL-4】【空白】加入100pL染色緩沖液室溫避光15min后，每管中加入2ml染色緩沖液混合均勻，1500rpm，5min離心，棄上清，留沉淀。5） 固定和透化細(xì)胞每管中加入500pl固定/透化劑（棕色瓶），充分混勻，避光20min，1500rpm離心5min，棄上清，留沉淀。加2ml1xBDPerm/washTMBuffer（預(yù)實(shí)驗(yàn)中用之前留下來(lái)的試劑），避光10min，1500rpm，離心5min，棄上清，留沉淀。6)胞內(nèi)細(xì)胞因子的染色【CD4】【空白】加入100pLPerm/washTMBuffer【IFN-y】加入95pLPerm/washTMBuffer+5pLPEanti-mouseIFN-y(0.2mg/ml)【IL-4】加入95pLPerm/washTMBuffer+5pLPERatAnti-MouseIL-4(0.2mg/mL)【實(shí)驗(yàn)】【對(duì)照】5pLPEanti-mouseIFN-y(0.2mg/ml)+5pLPERatAnti-MouseIL-4(0.2mg/mL)