丙泊酚對(duì)HEK-293細(xì)胞中表達(dá)的hERG鉀通道及其無(wú)義突變體Q738X的抑制作用

丙泊酚對(duì)HEK-293細(xì)胞中表達(dá)的hERG鉀通道及其無(wú)義突變體Q738X的抑制作用長(zhǎng)QT綜合癥(IongQTsyndrome,LQTS)可分為先天遺傳性和后天獲得性L(fǎng)QTS二類(lèi)。先天性L(fǎng)QTS是由于編碼心肌細(xì)胞離子通道的基因突變導(dǎo)致相應(yīng)離子通道蛋白功能發(fā)生異常所致。目前已知的先天性L(fǎng)QTS的相關(guān)基因至少有十種,分別為L(zhǎng)QT1-LQT10其中LQT2是由于編碼快速激活的延遲整流鉀通道(rapidactivatingdelayedrectifierK+channel,IKr) 的hERG基因(humanether-a-go-go-relatedgene,hERG)發(fā)生突變所致,IKr通道是形成心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極3期的主要離子通道,對(duì)維持和決定動(dòng)作電位時(shí)程的長(zhǎng)短具有重要意義。最近報(bào)道在一日本遺傳性L(fǎng)QTS家系中發(fā)現(xiàn)了hERGS因的一個(gè)新的突變位點(diǎn)Q738X對(duì)該基因突變導(dǎo)致hERG鉀通道功能的改變迄今國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。獲得性L(fǎng)QTS主要是由于藥物引起,藥物主要通過(guò)兩種機(jī)制作用于hERG鉀通道：①直接抑制hERG鉀通道,藥物多與hERG鉀通道S6區(qū)域的兩個(gè)芳香族氨基酸Y652和F656具有高的親和力,引起心肌細(xì)胞復(fù)極3期K+外流減少；②影響hERG蛋白的運(yùn)輸過(guò)程,造成細(xì)胞膜表面的hERG蛋白數(shù)量減少。丙泊酚(propofol)又名異丙酚,是一種快速?gòu)?qiáng)效的全身麻醉劑,由丙泊酚引起的心電圖QT間期延長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)作性暈厥、心臟猝死的心律失常事件時(shí)有發(fā)生。關(guān)于丙泊酚對(duì)QT間期影響的報(bào)道結(jié)果不一,一些研究認(rèn)為丙泊酚能延長(zhǎng)QT間期，相反,有些報(bào)道認(rèn)為丙泊酚不影響甚至縮短QT間期。然而,在這些報(bào)道中丙泊酚常和其它藥物同時(shí)使用,很難判定是丙泊酚單獨(dú)作用的結(jié)果。我們假設(shè)丙泊酚對(duì)QT間期的影響及其機(jī)制可能與hERG鉀通道的抑制有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康模孩偻蛔凅wQ738X-hER啲功能鑒定；②探討丙泊酚對(duì)野生型(widetype,WT)hERG鉀通道和共轉(zhuǎn)染型WT/Q738X-hER鉀通道的影響；③丙泊酚對(duì)hERG鉀通道作用機(jī)制的探討,為臨床合理化和個(gè)體化用藥提供理論依據(jù)。方法1.PCR定點(diǎn)突變Q738XY652A和F656C-hERG采用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行Q738X,Y652A和F656C突變，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證突變成功。細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：人胚腎上皮細(xì)胞(humanembryonickidneycellline,HEK-293細(xì)胞)在含10%臺(tái)牛血清的高糖DMEI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用磷酸鈣沉淀或脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒包括：①野生型WT-hERG②突變型Q738XY652A和F656C-hERG③共轉(zhuǎn)染型：WT/Q738X-hERG；對(duì)照組WT-hER和空白質(zhì)粒PBI。全細(xì)胞膜片鉗記錄hERG鉀通道電流：尋找表達(dá)有綠色熒光的單個(gè)HEK-293細(xì)胞,采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，選用不同的實(shí)驗(yàn)方案，分別記錄野生型WT突變型Q738X共轉(zhuǎn)染型WT/Q738X和對(duì)照組的hERG鉀通道電流和其動(dòng)力學(xué)特征變化,以及丙泊酚對(duì)野生型WT突變型丫652A和F656C和共轉(zhuǎn)染型WT/Q738X-hER鉀通道電流和其動(dòng)力學(xué)特征的變化。Westernblot檢測(cè)hERGt白的表達(dá)：酶解收集蛋白，BCA法測(cè)蛋白含量,RIPA裂解蛋白,10%的SDS-PAG凝膠電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉，抗hERC抗體(1:200),4C孵育過(guò)夜,HRP標(biāo)記的二抗(1:10000),室溫孵育1h,ECL顯色。通過(guò)Quantityone軟件分析每條帶的灰密度值，與自身內(nèi)參B-actin條帶的灰密度相比,對(duì)每條帶進(jìn)行半定量分析。雙重細(xì)胞免疫熒光：分別觀(guān)察轉(zhuǎn)染W(wǎng)TQ738X和WT/Q738X-hER的HEK-293細(xì)胞上hERG蛋白的定位情況以及丙泊酚對(duì)WT-hER（蛋白定位的影響,轉(zhuǎn)染36?48h后4%多聚甲醛固定細(xì)胞,0.1%TritonX-100透化,2%牛血清白蛋白封閉,隨后加入兔源抗hERG蛋白抗體和雞源抗肌鈣網(wǎng)蛋白抗體,4°C孵育過(guò)夜,次日加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG和Alexafluor633 標(biāo)記的山羊抗雞IgG的二抗,封片劑封片。6.激光共聚焦技術(shù)將細(xì)胞免疫熒光染色的 HEK-293細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦定位,FITC（綠色）和Alexafluor（紅色）分別用波長(zhǎng)488nm的氬離子激光和633nm的氦氖離子激光激發(fā)。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)值用mea±S.E.M表示,使用pulse8.67軟件記錄和分析通道電流,采用SPSS13.0和Origin6.0軟件來(lái)擬合曲線(xiàn)和制圖,加藥前后采用配對(duì)t檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有顯著性。1.突變體Q738X-hER（的功能鑒定1.1突變體Q738X-hER電流的記錄將轉(zhuǎn)染有野生型WT-hERG勺HEK-293細(xì)胞進(jìn)行電生理記錄,顯示出典型的hERG鉀電流,由時(shí)間依賴(lài)性電流和尾電流兩部分組成。而在單獨(dú)表達(dá)有突變型Q738X-hERG勺HEK-293細(xì)胞中記錄不到電流。將WT-hER和Q738X-hERG各2卩g）共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中時(shí),雖可記錄到hERG甲電流，其電流圖形也與WT-hER（電流相似，但其電流幅度明顯低于WT-hERG（4卩g）而與WT-hERG（不g）電流大小相似。WT-hERG（險(xiǎn)g）、WT-hERG（不g）和WT/Q738X各2卩g）的尾電流幅度依次為59.94±3.0、32.2±1.7（P<0.05vs4卩gWT-hERG和26.2±3.5pA/pF（P<0.05vs4 卩gWT-hERG）通過(guò)對(duì)WT/Q738X勺動(dòng)力學(xué)觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)Q738X突變不改變hER住甲通道的動(dòng)力學(xué)特征（包括激活、失活和去活過(guò)程）。1.2突變體Q738X的運(yùn)輸障礙Westernblot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染野生型WT-hERG的HEK-293細(xì)胞中可以檢測(cè)到二條蛋白質(zhì)條帶(135和155KDa),而突變體Q738X-hER只出現(xiàn)135KDa一個(gè)條帶,共轉(zhuǎn)染型WT/Q738X-hER雖出現(xiàn)135和155KDa二條蛋白質(zhì)條帶,但其155KDa的條帶較弱。通過(guò)Quantityone軟件分析每條帶的灰密度值,對(duì)每條帶進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T/Q738X-hER雖有成熟的hERGt白(155KDa)的形成,但是表達(dá)量少于WT-hERG(P<0.01)。說(shuō)明Q738X的突變影響hERGt白的運(yùn)輸,使其到達(dá)細(xì)胞膜表面有功能的hERGg白數(shù)量減少。雙重細(xì)胞免疫熒光染色后經(jīng)激光共聚焦定位顯示：轉(zhuǎn)染有 WT-hERG勺HEK-293細(xì)胞,其綠色熒光主要分布在細(xì)胞膜上，與ERmarker(紅光)共定位后，雖有部分重疊，但膜上的綠色熒光仍然很清楚；而轉(zhuǎn)染有突變體 Q738X-hERG勺HEK-293細(xì)胞,其綠色熒光主要分布在胞漿中,與ERmarker共定位后,完全重合,說(shuō)明突變體Q738X-hER蛋白分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中；當(dāng)將WT和Q738X共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞時(shí),雖在胞漿處有部分重疊，但膜上仍有綠色熒光。2.丙泊酚對(duì)WT-hERG甲通道的影響2.1丙泊酚對(duì)WT-hERG甲通道的直接影響丙泊酚濃度依賴(lài)性的抑制WT-hERG?通道，當(dāng)濃度為0.01、0.1、1、3、10、30、100、300、1000和3000卩M時(shí)，丙泊酚對(duì)WT-hERG?通道的抑制率依次為3.8±2.4%、13.9±7.9%、17.0±5.5%、23.2+5.0%、29.8±4.9%、43.7±5.4%、58.2±4.8、66.4±7.5%、71.2±4.3%和84.3+4.1%,丙泊酚抑制WT-hERG?通道的IC50值為60.9±6.4卩M使用“尾電流包裹”的實(shí)驗(yàn)方法觀(guān)察10卩M丙泊酚對(duì)WT-hERG甲通道的時(shí)間依賴(lài)性,結(jié)果顯示,隨著刺激時(shí)程的延長(zhǎng),丙泊酚對(duì)WT-hERG甲通道尾電流的抑制程度增加,但大約在1500ms之后,抑制率達(dá)到43.6±3.8%不再有明顯增加,說(shuō)明丙泊酚對(duì)WT-hERG甲通道的抑制具有時(shí)間依賴(lài)性。觀(guān)察10卩M丙泊酚對(duì)WT-hER鉀電流的頻率依賴(lài)性,在頻率為1Hz時(shí)，加藥后對(duì)WT-hER鉀電流的抑制率為71.0±2.1%;在頻率為0.2Hz時(shí)，其抑制率為69.4±2.3%。盡管頻率不同,但加藥后的電流抑制率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,無(wú)顯著差異(P>0.05),說(shuō)明丙泊酚對(duì)WT-hERGf電流的抑制無(wú)頻率依賴(lài)性。通過(guò)觀(guān)察10卩M丙泊酚對(duì)WT-hERG甲通道動(dòng)力學(xué)的影響,表明10卩M丙泊酚對(duì)其動(dòng)力學(xué)特性(包括激活、失活和去活)均無(wú)影響。為了解丙泊酚和hERG基因S6區(qū)域的兩個(gè)位點(diǎn)丫652和F656是否具有高親和力，本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察了丙泊酚對(duì)突變體Y652A和F656C的作用,結(jié)果顯示,300卩M的丙泊酚對(duì)WT-hER鉀通道的抑制率為66.3±7.5%,而對(duì)Y652A-hERG甲通道的抑制率僅為21.3±4.1%(P<0.05vsWT-hERG)丙泊酚抑制Y652A-hERG甲通道電流的IC50值為2871.8±351.9卩M當(dāng)丙泊酚的濃度為100、300、1000和3000卩M時(shí)，其對(duì)WT-hERG甲通道電流分別抑制了51.0±5.2%、62.4±5.9%、88.4±3.3%和94.7±2.1%;對(duì)F656C-hERG鉀通道電流分別抑制了8.3±4.5%、21.2±6.3%、39.5±6.7%和45.0±8.3%(P<0.05vsWT-hERG),可見(jiàn)Y652A和F656C的突變均削弱了丙泊酚抑制WT-hER鉀通道的能力。2.2丙泊酚對(duì)WT-hER蛋白運(yùn)輸?shù)挠绊懡?jīng)Westernblot分析和激光共聚焦結(jié)果顯示丙泊酚對(duì)WT-hERG!白的表達(dá)和定位無(wú)影響。3.丙泊酚對(duì)WT/Q738X-hER鉀通道的影響丙泊酚濃度依賴(lài)性的抑制 WT/Q738X-hER鉀通道,當(dāng)濃度為0.1、1、3、10、30、100和1000卩M時(shí)，丙泊酚依次對(duì)WT/Q738X-hERG鉀通道的抑制率為2.9±4.9%、11.6±3.8%、33.7+3.2%、48.9±2.5%、55.8±3.8%、80.1±2.9%和87.5±2.9%,丙泊酚抑制WT/Q738X-hER鉀通道的IC50值為14.2±2