甲霜靈和布洛芬手性對(duì)映體的定量模型

甲霜靈和布洛芬手性對(duì)映體的定量模型

手性藥物的測(cè)定不同的手性藥物吸收的光學(xué)映射體可能具有不同的生物活性，甚至具有相反的生物活性。代謝路徑和代謝產(chǎn)物的毒副作用也不同。甲霜靈的R對(duì)映體(俗稱精甲霜靈)的活性要比S對(duì)映體高20倍以上;與外消旋化合物相比,S-布洛芬可以快速在血液中達(dá)到治療濃度,具有更好的臨床效果;沙利度胺(thalidomide,商品名:反應(yīng)停)R-對(duì)映體有鎮(zhèn)靜作用,其S-對(duì)映體的2個(gè)體內(nèi)代謝產(chǎn)物有嚴(yán)重的胚胎毒性和致畸作用。隨著手性藥物產(chǎn)量的大幅提升,國(guó)外已經(jīng)建立手性藥物的質(zhì)量分析與控制規(guī)程,手性藥物的快速測(cè)定對(duì)于藥物質(zhì)量控制有著重要的意義。目前,手性對(duì)映體組成測(cè)定常用高效液相色譜法,但是該方法分析時(shí)間較長(zhǎng),操作復(fù)雜,不能滿足大批量產(chǎn)品質(zhì)量測(cè)定的需要。紫外光譜法是一種簡(jiǎn)單、方便的分析方法,該方法應(yīng)用于手性對(duì)映體組成的測(cè)定已有文獻(xiàn)報(bào)道,并已經(jīng)應(yīng)用于制藥企業(yè)的質(zhì)量分析。眾所周知,在非手性介質(zhì)中,不同手性對(duì)映體的紫外吸收光譜是相同的,紫外-可見(jiàn)光譜法無(wú)法直接測(cè)定其對(duì)映體的組成。但是用手性輔助試劑與手性化合物作用形成包絡(luò)物后,不同手性對(duì)映體形成包絡(luò)物的模式不同,其紫外吸收光譜會(huì)有小的差異,形成包絡(luò)物常多于2種,無(wú)法用比爾定律直接進(jìn)行多組分定量分析。偏最小二乘法(PLS)可以從微小的的數(shù)據(jù)差異中提取與分析物相關(guān)的信息,建立光譜與分析物組成的定量分析模型,可用于有機(jī)物手性對(duì)映體組成的定量分析。手性試劑的選擇對(duì)本方法至關(guān)重要,最常用的手性試劑是環(huán)糊精及其衍生物,我們前期工作也表明,環(huán)糊精作為手性選擇試劑可以用于甲霜靈對(duì)映體組成的測(cè)定。然而其低溶解度導(dǎo)致樣品吸收強(qiáng)度較弱,同時(shí)環(huán)糊精的價(jià)格較昂貴。蔗糖是一種常見(jiàn)的手性物質(zhì),具有良好的水溶性,并且價(jià)格便宜,有文獻(xiàn)報(bào)道采用蔗糖為手性選擇劑結(jié)合近紅外光譜測(cè)定普萘洛(propranolol)和阿替洛(atenolol)等手性藥物的組成。但采用蔗糖作為手性選擇試劑,紫外光譜法測(cè)定藥物對(duì)映體組成尚未見(jiàn)報(bào)道。本工作采用蔗糖做手性試劑,紫外-可見(jiàn)光譜結(jié)合偏最小二乘法分別測(cè)定農(nóng)藥甲霜靈和藥物布洛芬這兩種手性化合物對(duì)映體的組成,為手性農(nóng)藥和手性藥物對(duì)映體組成的快速測(cè)定提供了新的途徑。1實(shí)驗(yàn)部分1.1化學(xué)試劑及試劑布洛芬(AR,上海新楚明化工有限公司),S-布洛芬(99%,AcrosOrganics),外消旋體甲霜靈原藥(96%,深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司),精甲霜靈原藥(98%,山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室),蔗糖(AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),甲醇(AR,北京化工廠)。氫氧化鈉(AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),磷酸氫二鈉(AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),磷酸二氫鈉(AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),Lamda35紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)及Quant+V4.51化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件(PerkinElmer,美國(guó)),XS204型分析天平(Mettlertoledo,瑞士),SevenMulti型pH計(jì)(Mettlertoledo,瑞士)。1.2外消旋甲霜靈-蔗糖添加量的確定藥物產(chǎn)品通常具有非常高的純度,實(shí)驗(yàn)中溶液的總組分?jǐn)?shù)較少,背景簡(jiǎn)單,而且液體透射測(cè)量條件下,吸光度與含量成線性關(guān)系,因此建立數(shù)學(xué)模型的校正集樣品數(shù)量可以相對(duì)較少;同時(shí)為了避免總濃度對(duì)光譜的影響,使光譜的變化僅僅與對(duì)映體比例的差異有關(guān),實(shí)驗(yàn)中所有樣品的總濃度保持相同。配制21.00mmol·L-1的蔗糖溶液,再用配好的蔗糖溶液配制1.61mmol·L-1的外消旋甲霜靈-蔗糖和精甲霜靈-蔗糖溶液。取21個(gè)50mL容量瓶分別編號(hào),按1號(hào)至21號(hào)順序分別加入50～0mL(10,11,12,13號(hào)間隔1mL;1,2,13,14號(hào)間隔2mL;其余間隔3mL)甲霜靈-蔗糖溶液,再依次加入精甲霜靈-蔗糖溶液至刻度,得到21個(gè)樣品溶液,其中精甲霜靈的摩爾分?jǐn)?shù)范圍為0.5～1.0。配制pH11磷酸鹽緩沖溶液,用此緩沖溶液來(lái)配制0.25mmol·L-1蔗糖的磷酸鹽緩沖溶液。再用該蔗糖磷酸鹽緩沖溶液來(lái)配制0.12mmol·L-1布洛芬-蔗糖溶液和0.12mmol·L-1的S-布洛芬-蔗糖溶液。取21個(gè)10mL容量瓶分別編號(hào),按1號(hào)至21號(hào)順序分別加入10～0mL(每個(gè)間隔0.5mL)布洛芬-蔗糖溶液,再依次加入不同的S-布洛芬-蔗糖溶液至刻度,得到21個(gè)樣品溶液,其中S-布洛芬的摩爾分?jǐn)?shù)范圍是0.5～1.0。1.3甲霜靈r定量模型構(gòu)建儀器帶寬1nm,波長(zhǎng)點(diǎn)間隔0.2nm,掃描速度60nm·min-1,1cm石英比色杯。甲霜靈-蔗糖溶液光譜掃描波長(zhǎng)范圍為230～290nm,蔗糖溶液做參比。為了保證校正集和檢驗(yàn)集的代表性,21個(gè)樣品按照摩爾分?jǐn)?shù)順序選擇3,6,9,12,15,18號(hào)共計(jì)6個(gè)樣品作為獨(dú)立外部檢驗(yàn)集,其余15個(gè)樣品作為校正集,用偏最小二乘法(PLS)建立甲霜靈R對(duì)映體(精甲霜靈)含量的定量模型,用外部檢驗(yàn)集標(biāo)準(zhǔn)差SEP來(lái)評(píng)價(jià)模型性能。布洛芬-蔗糖溶液光譜掃描波長(zhǎng)范圍為210～300nm,pH11的蔗糖-磷酸鹽溶液做參比。21個(gè)樣品按照摩爾分?jǐn)?shù)順序選擇2,5,8,11,14,17,20號(hào)共計(jì)7個(gè)樣品作為獨(dú)立外部檢驗(yàn)集;其余14個(gè)樣品作為校正集,用偏最小二乘法(PLS)建立布洛芬S-對(duì)映體摩爾分?jǐn)?shù)的定量模型,外部檢驗(yàn)集標(biāo)準(zhǔn)差SEP來(lái)評(píng)價(jià)模型性能。2結(jié)果與討論2.1甲霜靈正體組成的測(cè)量模型2.1.1峰谷處變化迅速,峰谷處變化得不顯著圖1是21個(gè)甲霜靈-蔗糖樣品溶液的紫外光譜,從圖中看出,隨著精甲霜靈摩爾分?jǐn)?shù)的提高,溶液的吸光度值逐漸增大,且最大吸收峰位置有微小移動(dòng),峰的輪廓有小的差異,尤其在245nm附近的峰谷處變化較明顯,這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)糊精體系的現(xiàn)象相一致。由于不同樣品中甲霜靈的總濃度保持一定,僅僅是R和S異構(gòu)體的比例不同,因此光譜差異是由于R-甲霜靈和S-甲霜靈的比例不同而導(dǎo)致的,這是進(jìn)行多組分定量分析的基礎(chǔ)。2.1.2異常值的計(jì)算采用偏最小二乘法結(jié)合光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理從微小光譜變化中提取有用信息建立可靠的定量分析模型。選擇5點(diǎn)平滑對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理,光譜集和濃度集均進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理。優(yōu)化后精甲霜靈摩爾分?jǐn)?shù)定量分析模型最佳載荷向量數(shù)選為3階(F檢驗(yàn)),前3個(gè)載荷向量圖見(jiàn)圖2(a)—(c),可以看出,第一特征向量(貢獻(xiàn)率為94.5%)、第二特征向量(貢獻(xiàn)率為5.0%)中245nm附近的貢獻(xiàn)最大,這與原光譜中該處變化較為顯著相一致,說(shuō)明偏最小二乘回歸模型主要利用該處的信息。偏最小二乘法建立精甲霜靈摩爾分?jǐn)?shù)校正模型,異常值檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3,無(wú)異常樣品剔除。模型校正集的決定系數(shù)R2為99.98%,精甲霜靈摩爾分?jǐn)?shù)的預(yù)測(cè)值與理論值的相關(guān)系數(shù)為0.9999,見(jiàn)圖4(a),標(biāo)準(zhǔn)偏差SEC為0.003,校正集樣品摩爾分?jǐn)?shù)平均值為0.75,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.4%。外部獨(dú)立檢驗(yàn)集的評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖4(b),預(yù)測(cè)值與理論值的相關(guān)系數(shù)為0.9998,標(biāo)準(zhǔn)偏差SEP為0.0004,摩爾分?jǐn)?shù)均值為0.735,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.054%。獨(dú)立檢驗(yàn)結(jié)果表明,樣品的預(yù)測(cè)值和理論值之間有很好的相關(guān)性,該方法可用于甲霜靈手性對(duì)映體組成的快速測(cè)定。2.2布洛芬手稿組成的測(cè)量模型2.2.1最大吸收和測(cè)定樣品含量,含量測(cè)定為掃描線,吸光度隨時(shí)間的變化,樣品測(cè)定加圖5是21個(gè)布洛芬-蔗糖樣品溶液的紫外光譜圖,從圖中看出,隨著S-布洛芬摩爾分?jǐn)?shù)的提高,樣品最大吸收224nm處的吸光度明顯增大,最大吸收位置有微小的藍(lán)移。由于不同樣品中布洛芬的總濃度是相同的,因此光譜差異是S-布洛芬摩爾分?jǐn)?shù)變化導(dǎo)致的,這說(shuō)明蔗糖對(duì)布洛芬存在手性選擇作用,這是進(jìn)行布洛芬對(duì)映體組成定量分析的譜學(xué)基礎(chǔ)。2.2.2s-布洛芬摩爾分?jǐn)?shù)a選擇5點(diǎn)平滑對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理,對(duì)光譜集和濃度集數(shù)據(jù)均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(Autoscale)處理。用偏最小二乘法(PLS)建立布洛芬S-對(duì)映體摩爾分?jǐn)?shù)的定量分析模型,SEP與維數(shù)關(guān)系圖見(jiàn)圖6,載荷向量最佳維數(shù)為3階(F檢驗(yàn)),前三個(gè)載荷向量圖見(jiàn)圖7(a)—7(c),第一載荷向量(貢獻(xiàn)率為73.6%)和第二載荷向量(貢獻(xiàn)率為24.8%)主要信息為224nm最大吸收峰。校正集異常值檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8,無(wú)異常樣品剔除,校正模型的決定系數(shù)R2為99.84%,S-布洛芬摩爾分?jǐn)?shù)的預(yù)測(cè)值與理論值的相關(guān)系數(shù)r為0.9992,見(jiàn)圖9(a),標(biāo)準(zhǔn)偏差SEC為0.007,校正集樣品平均值為0.77,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.9%。模型外部獨(dú)立檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9(b),S-布洛芬摩爾分?jǐn)?shù)的預(yù)測(cè)值與理論值的相關(guān)系數(shù)為0.9981,檢驗(yàn)集樣品均值為0.77,SEP為0.002,RSD為0.3%。外部檢驗(yàn)結(jié)果表明,所建立的定量模型可以用于S-布洛芬摩爾分?jǐn)?shù)的快速測(cè)定。3手性介質(zhì)中光學(xué)成分的檢測(cè)以手性農(nóng)藥甲霜靈和手性藥物布洛芬為研究對(duì)象,用蔗糖作為手性選擇試劑,紫外-可見(jiàn)光譜結(jié)合偏最小二乘法(PLS)分別建立精甲霜靈和S-布洛芬對(duì)映體摩爾分?jǐn)?shù)的定量模型,結(jié)果表明:(1)甲霜靈和布洛芬與蔗糖的手性作用結(jié)果在光譜上存在差異;甲霜靈-蔗糖體系中,隨著R-甲霜靈摩爾分?jǐn)?shù)增加,峰谷吸收強(qiáng)度有一定的提高,最大吸峰變化不大;布洛芬-蔗糖體系中,隨著S-布洛芬摩爾分?jǐn)?shù)增加,最大吸收峰224nm吸收強(qiáng)度有明顯的提高,峰谷變化不大;(2)精甲霜靈摩爾分?jǐn)?shù)的定量模型校正集的決定系數(shù)R2為99.98%,標(biāo)準(zhǔn)偏差SEC為0.003;外部檢驗(yàn)集預(yù)測(cè)值與理論值的相關(guān)系數(shù)為0.9998,標(biāo)準(zhǔn)偏差SEP為0.0004,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.054