青枯雷爾氏菌脂肪酸型種下分化的分類方法

青枯雷爾氏菌脂肪酸型種下分化的分類方法

0青枯雷爾氏菌種下分化的分析方法【研究意義】植物細菌的綠色干燥病是由綠枯萎雷土（ralstoniasona）引起的毀滅性土壤傳播疾病。青枯雷爾氏菌可危害44個科300多種植物，造成農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)巨大經(jīng)濟損失?！厩叭搜芯窟M展】青枯雷爾氏菌在寄主范圍、地理分布、致病特征、流行特征、種下分化等方面存在較大的差異，具有明顯的多態(tài)性。青枯雷爾氏菌的種下分化復(fù)雜，前人從生理小種（race）、生化型（biovar）、血清型（serotype）、溶源型（lysotype）、基因型（genetype）等方面對種下分化進行研究。然而，許多研究表明，采用的種下分化的分析方法與青枯雷爾氏菌的致病性無特定的相關(guān)性，同一個生理小種的青枯雷爾氏菌中存在著不同的致病性菌株。王國平等分析了湖南省煙草青枯雷爾氏菌的生化型，認為青枯雷爾氏菌致病力的強弱與生化型沒有直接的相關(guān)性。血清型、溶源型、基因型的分析，無法區(qū)別不同致病力的青枯雷爾氏菌菌株?！颈狙芯壳腥朦c】尋找與致病性相關(guān)的青枯雷爾氏菌種下分化的分析方法，成為研究的焦點。微生物學(xué)研究表明：細胞結(jié)構(gòu)中普遍含有的脂肪酸成分與細菌的DNA具有高度的同源性，各種細菌具有其特征性的細胞脂肪酸指紋圖譜，可用于建立脂肪酸細菌鑒定系統(tǒng)方法。脂肪酸是構(gòu)成青枯雷爾氏菌生物膜的重要物質(zhì)，作為細胞表面物質(zhì)與細胞識別、種下特異性和細胞免疫等有密切關(guān)系。表面脂肪酸能有效地用于與致病力相關(guān)的青枯雷爾氏菌種下分化的分析有過報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文利用與青枯雷爾氏菌致病力相關(guān)的指標——弱化指數(shù)和回接組培苗發(fā)病率，通過聚類分析建立不同致病性菌株脂肪酸模式類型，對菌株的脂肪酸種類進行聚類分析，通過主成分分析，找到與致病性相關(guān)的脂肪酸的主要成分，用判別分析建立青枯雷爾氏菌脂肪酸型判別模型，為青枯雷爾氏菌脂肪酸型的鑒別提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1青枯雷爾氏菌的分離純化從福建省經(jīng)濟作物番茄、茄子、辣椒和生姜青枯病嚴重發(fā)生的田塊采集樣本，參照方中達的方法，用2,3,5-氯化三苯基四氮唑培養(yǎng)基（簡稱TZC）培養(yǎng)基分離純化，得到40株青枯雷爾氏菌，保存于20～25℃的無菌水中，備用。菌種來源見表1。1.2脂肪酸甲酯混合物標樣和待檢樣本的制備脂肪酸提取所用的試劑：包括脂肪酸甲酯混合物標樣（由美國MIDI公司提供）、菌落收集培養(yǎng)基（TSB培養(yǎng)基）、脂肪酸提取所需試劑[皂化試劑、甲基化試劑、萃取試劑和洗滌試劑（由美國Fisher公司提供）]，除脂肪酸甲酯混合物標樣為直接應(yīng)用外，其它試劑配制由MIDI公司提供；脂肪酸的提取包括菌落收集、細菌細胞皂化釋放脂肪酸、脂肪酸的甲基化、脂肪酸甲酯萃取和基本洗滌等步驟，具體操作由Midi公司提供。在下述色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標樣和待檢樣本：二階程序升高柱溫，170℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升溫至310℃，維持90S；汽化室溫度250℃、檢測器溫度300℃；載氣為氫氣（2ml·min-1）、尾吹氣為氮氣（30ml·min-1）；柱前壓10.00psi(1psi=6.895kPa）；進樣量1μl，進樣分流比100﹕1。氣相色譜系統(tǒng)采用的是美國Agilent6890型（AgilentChromatograph:GC），包括全自動進樣裝置、石英毛細管柱及氫火焰離子化檢測器；分析軟件應(yīng)用美國MIDI公司開發(fā)的基于細菌細胞脂肪酸成分鑒定細菌的軟件MIS4.5(MicrobialIdentificationSystem）和LGS4.5(LibraryGenerationSoftware）。1.3田間致病類型的確定將上述40株青枯雷爾氏菌（表1）作為研究對象，在TZC平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)青枯雷爾氏菌單細胞菌落，按照劉波等建立的弱化指數(shù)的測定方法，測定40株供試菌株的弱化指數(shù)N=D1/D2，（其中N為弱化指數(shù)，D1和D2分別表示在TZC平板培養(yǎng)基上青枯雷爾氏菌細胞單菌落的紅斑半徑和菌落半徑），每個菌株測定60個單菌落弱化指數(shù)，同時用剪葉法對測定過弱化指數(shù)的青枯雷爾氏菌單菌落進行番茄組培苗回接，每個菌株選擇30個測定過弱化指數(shù)的單菌落回接30株組培苗，設(shè)清水對照，將回接的組培苗放置于28～30℃的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，10d后觀察發(fā)病率。根據(jù)弱化指數(shù)和回接發(fā)病率，確定其致病類型。比較青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與其致病性之間相互關(guān)系。1.4青枯雷爾氏菌的圖譜選擇青枯雷爾氏菌脂肪酸指紋圖譜匹配率最高菌株的圖譜作為模式圖譜，說明青枯雷爾氏菌脂肪酸種類、特征、種類鑒定參數(shù)等。對被測的40株菌株特征峰值，用DPS軟件進行方差分析。1.5青枯雷爾氏菌脂肪酸分型以脂肪酸種類為指標，以菌株為樣本，構(gòu)建聚類分析數(shù)據(jù)矩陣，以歐氏距離為相關(guān)尺度，用類平均法為聚類方法，利用LGS軟件對40株青枯雷爾氏菌脂肪酸色譜結(jié)果進行聚類分析，得出系統(tǒng)樹圖，分析脂肪酸特點的菌株脂肪酸型類別，與菌株致病性指標弱化指數(shù)和發(fā)病率進行比較，闡明菌株脂肪酸型與致病性的相互關(guān)系。1.6脂肪酸型判別模型的建立首先，進行脂肪酸特征色譜同質(zhì)性聚類分析，選擇40株被測菌株的脂肪酸特征色譜18個峰值數(shù)據(jù)，以菌株為指標，以色譜峰值為樣本，構(gòu)建分析矩陣，以馬氏距離為相關(guān)尺度，用類平均法為聚類方法，將色譜峰進行系統(tǒng)聚類，分成不同的色譜峰組，同一色譜峰組的脂肪酸峰具有同質(zhì)性。其次，進行各色譜峰組中關(guān)鍵成分分析，用主成分分析選擇色譜峰組中的主要成分，以累計特征值大于90%為指標，在因子得分矩陣中，從各色譜峰組中選擇一個得分因子總和為最高的色譜峰，組成色譜峰組特征脂肪酸。最后利用判別分析建立脂肪酸型判別模型，以選出的特征脂肪酸為指標（Xj），被測的青枯雷爾氏菌菌株（Xi）為樣本，青枯雷爾氏菌脂肪酸型級別（Y）為測定值，以組建判別分析數(shù)據(jù)矩陣如下：其中，j為脂肪酸峰序號，i為菌株脂肪酸型級別序號。用Bayes逐步判別方法建模，多組逐步判別分析是按照Bayes準則，用WILKS統(tǒng)計量從M個因子中，根據(jù)各因子判別能力大小的顯著性檢驗結(jié)果，精選出若干判別能力大的且配合較好的因子，建立Bayes判別函數(shù)。并可判別新的樣本是屬于哪一組。Bayes判別函數(shù)方程：聚類分析、主成分分析、判別分析采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行計算。2結(jié)果與分析2.1不同脂肪酸峰的劃分試驗結(jié)果見表2。選用的青枯雷爾氏菌為25號，菌株名稱Rs-T.1.3-010702-25，采集地點福州北峰，寄主植物番茄，采集日期2001年07月02日。色譜的有效峰從保留時間1.776起點到保留時間16.332為終點，共18個峰，每個峰代表一（類）脂肪酸。不同的菌株，峰的數(shù)量、峰值大小和脂肪酸種類不同。大部分菌株鑒定用的脂肪酸峰從序號4（即十四碳脂肪酸）開始，到序號18（即十八碳脂肪酸）結(jié)束，約15組脂肪酸。不同的菌株，進入鑒定判別脂肪酸峰的數(shù)量不同，就該菌株而言，進入鑒定參考的脂肪酸峰有8條，即序號4、5、8、9、10、11、16、17。不同脂肪酸峰值百分比不同，就該菌而言，<1%的脂肪酸有序號5、9、11、13、14、17,1%～9%的脂肪酸有序號4、6、10、12、16、18,10%～30%的脂肪酸有序號7、8、15。青枯雷爾氏菌脂肪酸特征圖譜見圖1。被測的青枯雷爾氏菌40株菌株，脂肪酸種類最多的為22種，最少的為17種。選擇較為常見的18種脂肪酸，進行方差分析，結(jié)果可知菌株的脂肪酸種類間差異顯著（P<0.01），不同菌株間差異顯著（P<0.01）。不同的菌株，脂肪酸出現(xiàn)的種類不同，有的脂肪酸在所有菌株中出現(xiàn)，如十四碳脂肪酸（C14﹕0）、混合脂肪酸（C14﹕03OH/16﹕1ISOI）、混合脂肪酸（C16﹕01ω7c/C15ISO2OH）、十六碳脂肪酸（C16﹕0）、2-羥基十六碳脂肪酸（C16﹕12OH）、ω7c-十八碳脂肪酸（C18﹕1ω7c）、2-羥基十八碳脂肪酸（C18﹕12OH），能進入計算機進行種類鑒定的脂肪酸一般為5～8種，當相似性指數(shù)大于0.5時，被計算機判別為青枯雷爾氏菌。2.2青枯雷爾氏菌的致病性利用LGS軟件對40株青枯雷爾氏菌脂肪酸色譜結(jié)果進行聚類分析，系統(tǒng)樹圖（dendrogram）見圖2?；贚GS軟件，樣品的歐氏距離（euclidiandistance）在10或以下時為同一種菌（species）；歐氏距離為6時，表示同一種的不同類群。從圖2可以看出，當λ=6.15時，40株青枯雷爾氏菌分成3個脂肪酸型類群，可用脂肪酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型（groupⅠ、Ⅱ、Ⅲ）表示。3個類群脂肪酸之間的主要差異（表3）：有（1）平均脂肪酸種類：groupⅠ最多，有22種，groupⅡ最少，有17種，groupⅢ介于兩者之間，有19種。（2）主要脂肪酸的平均含量：3個類群中含量最低的脂肪酸都是C18﹕1ω7c，而在groupⅢ中其含量（16.23%）明顯的低于其在groupⅠ（20.21%）和groupⅡ（21.14%）中的含量；含量最高的脂肪酸，在groupⅠ和groupⅡ中是C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH含量最高，在groupⅢ中則是C16﹕0含量最高；C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH和C16﹕0含量的差值，groupⅠ（9.01%）明顯大于groupⅡ（4.54%）。（3）在groupⅠ中，第3個特征性色譜峰C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH和第4個特征性色譜峰C16﹕0之間出現(xiàn)一個小的波峰，而在groupⅡ和groupⅢ中則沒有。（4）代表非優(yōu)勢脂肪酸的小波峰，在groupⅠ中，主要集中在第1個特征性色譜峰C14﹕0和第2個特征性色譜峰C14﹕03OH/C16﹕1ISOⅠ之間以及第4個特征性色譜峰C16﹕0和第5個特征性色譜峰C18﹕1ω7c之間，而在groupⅡ和groupⅢ中，只有第4個特征性色譜峰C16﹕0和第5個特征性色譜峰C18﹕1ω7c之間比較多。測定供試的40株青枯雷爾氏菌菌株的序號、菌株名稱、相似性指數(shù)、弱化指數(shù)和回接發(fā)病率、脂肪酸型、致病類型見表4。根據(jù)劉波等的研究，菌株的致病性區(qū)間劃分如下：弱化指數(shù)<0.60時，菌株回接發(fā)病率為100%，定義為強致病力菌株；弱化指數(shù)>0.80時，菌株回接發(fā)病率為0，定義為無致病性菌株；弱化指數(shù)介于0.60和0.80之間的，菌株的致病性為不確定性，定義為過渡性菌株。從表4可以看出，脂肪酸Ⅰ型菌株的弱化指數(shù)>0.80，菌株回接發(fā)病率為0，為無致病性菌株；脂肪酸Ⅲ型的弱化指數(shù)<0.60，菌株回接發(fā)病率為100%，為強致病性菌株；脂肪酸Ⅱ型的弱化指數(shù)介于0.60和0.80之間，菌株回接發(fā)病率在6.7%～100%之間變動，為過渡性菌株。表明青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與致病性之間存在著相關(guān)性。2.3青枯雷爾氏菌脂肪酸型的篩選首先，選擇40株被測菌株的脂肪酸色譜18個峰值數(shù)據(jù)，以菌株為指標，以色譜峰值為樣本，構(gòu)建分析矩陣，以馬氏距離為相關(guān)尺度，用類平均法為聚類方法，將色譜峰進行Q型系統(tǒng)聚類，分成不同的色譜峰組，分析結(jié)果見圖3，當λ=10.84時，脂肪酸種類可以分為3組，第1組包括了1～7序號的脂肪酸種類，第2組包括了8～11序號的脂肪酸種類，第1組包括了12～18序號的脂肪酸種類，同一色譜峰組的脂肪酸峰具有同質(zhì)性。其次，用主成分分析選擇色譜峰組中的主要成分，以累計特征值大于90%為指標，在因子得分矩陣中，從各色譜峰組中選擇一個因子得分總和最高的色譜峰，組成色譜峰組特征脂肪酸。分析結(jié)果見表5。前3個主成分的特征值的累計百分比達90.8217%，表明前3個主成分代表了總體信息量的90%以上。前3個主成分的因子得分按脂肪酸色譜峰組歸類見表6。從各脂肪酸組中選擇一個因子得分總和最高的成分，作為判別模型建立的因子，選擇Y(i,1）即十四碳脂肪酸（14﹕0）因子、Y(i,9）即十七碳脂肪酸因子（17﹕00）、Y(i,13）即十八碳脂肪酸因子（18﹕0）（表5）。最后，以選出的特征脂肪酸為指標（Xj），被測的青枯雷爾氏菌菌株（Xi）為樣本，青枯雷爾氏菌脂肪酸型級別（Y）為測定值，以組建判別分析數(shù)據(jù)矩陣如表7。當Fa臨界值=5.00時，計算結(jié)果建立的判別模型如下：Y1=-16.3353+0.0012X1+0.0056X9-0.0016X13Y2=-3.4928+0.0002X1+0.0003X9+0.0025X13Y3=-9.1550-0.0003X1+0.0039X9+0.0042X13式中，X1代表十四碳脂肪酸，X9代表十七碳脂肪酸，X13代表十八碳脂肪酸，Yi代表第i類脂肪酸型。計算后分類和后驗概率見表8。模型對青枯雷爾氏菌脂肪酸型的判別準確率達92.50%，對于40個菌株的脂肪酸型的判別，錯誤4個，分別是7、26、34、37號菌株，判別錯誤的原因都是將原來屬于脂肪酸型Ⅲ的判別成脂肪酸型Ⅱ，判錯的級別不算太高，因為脂肪酸型Ⅱ?qū)龠^渡型，其中存在著致病性菌株，模型的判別精確度可以滿足青枯雷爾氏菌脂肪酸型歸類。模型的用法為，對于一個未知脂肪酸型的青枯雷爾氏菌菌株，首先測定脂肪酸圖譜，取出X1（十四碳脂肪酸）、X9（十七碳脂肪酸）、X13（十八碳脂肪酸），代入方程，計算Yi，當1≤Yi≤2時，歸為脂肪酸型Ⅰ，當2≤Yi≤3時，歸為脂肪酸型Ⅱ，當Yi>3時，歸為脂肪酸型Ⅲ。3青枯雷爾氏菌脂肪酸型的判別模型青枯雷爾氏菌作為模式微生物，完成了基因組的測序。青枯雷爾氏菌作為植物病原菌，具有十分豐富的多態(tài)性，在寄主中有單子葉、雙子葉，1年生、多年生，草本、木本，表現(xiàn)出高度的生態(tài)適應(yīng)性，這種適應(yīng)性導(dǎo)致該菌的種下分化的復(fù)雜性。以往的研究提出了青枯雷爾氏菌生理小種（race）、生化型（biovar）、血清型（serotype）、溶源型（lysotype）、基因型（genetype）等，試圖從不同角度，解釋種下分化與致病性的關(guān)系，但是研究結(jié)果表明，該菌的各種下分化的分析方法無法與其致病性建立相關(guān)關(guān)系。從基因分析結(jié)果表明，青枯雷爾氏菌的致病性至少由22個基因控制，任何一個基因的改變都會改變其致病性，這給基因分析方法進行致病力檢測帶來了很大的困難。尋求簡易可行、穩(wěn)定可靠的分析青枯雷爾氏菌致病性分化的方法，是研究該菌致病力變化的核心。脂肪酸是構(gòu)成細菌生物膜的重要物質(zhì)；作為細胞表面物質(zhì)與細胞識別、種族特異性、遺傳變異、毒力、耐藥性和細胞免疫等有密切關(guān)系，同時其分析方法簡便，標準化程度高，具有較高的穩(wěn)定性，用于青枯雷爾氏菌種下分化的分析是個理想方法，作者分析青枯雷爾氏菌脂肪酸型與其致病性關(guān)系，建立青枯雷爾氏菌脂肪酸型判別模型，該方法對于青枯雷爾氏菌種下分化的研究具有重要的意義。前人研究表明，青枯雷爾氏菌在不同寄主感病植株、在同一寄主不同侵染狀態(tài)植株和同一寄主不同發(fā)病階段植株體內(nèi)分布及其致病力存在著異質(zhì)性，根據(jù)弱化指數(shù)的劃分標準，青枯雷爾氏菌的分布在番茄體內(nèi)依次為根部>中部以上莖>中部以下莖；茄子和花生從根到上部莖依次含菌量逐漸降低；煙草根部和中部莖的含菌量顯著高于下部和上部莖；生姜下部莖的含菌量顯著高于姜塊和中上部莖。不同植物感病植株體內(nèi)青枯雷爾氏菌平均弱化指數(shù)的大小依次為茄子>煙草>花生>番茄>生姜。青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與其生理小種和生化型之間不存在相關(guān)關(guān)系，但是青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與致病性之間存在的相關(guān)性，可以作為青枯雷爾氏菌小種鑒定的新指標。但是青枯雷爾氏菌脂肪酸生物標記（biomarker）存在著質(zhì)和量的變化，這種變化反映致病性的變化，只有通過模型的建立，才能準確判斷青枯雷爾氏菌的致病性，本研究首次引入Bayes判別分析，建立青枯雷爾氏菌脂肪酸型的判別模型，并提出了判別模型建立中的因子選擇策略。在建立青枯雷爾氏菌脂肪酸型模型中，作者采用了分層因子篩選方法，首先通過青枯雷爾氏菌脂肪酸組成與致病性的關(guān)系，確定各菌株的脂肪酸型，而后用聚類分析，對