十三章節(jié)生物技術(shù)在植物育種中應(yīng)用市公開課獲獎?wù)n件省名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎?wù)n件

第十三章生物技術(shù)在植物育種中應(yīng)用

1/479

1、教學(xué)基本要求

（1）了解細(xì)胞工程與作物育種原理和基本方法；

（2）了解作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理和基本方法；

（3）了解分子標(biāo)識主要類型和分子標(biāo)識輔助選擇育種原理和基本方法。2/4792、教學(xué)基本內(nèi)容

第一節(jié)細(xì)胞工程與作物育種

一、細(xì)胞和組織培養(yǎng)與作物育種

二、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交

第二節(jié)作物育種轉(zhuǎn)基因技術(shù)

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展現(xiàn)實狀況

二、*轉(zhuǎn)基因育種程序

三、轉(zhuǎn)基因作物品種選育

四、轉(zhuǎn)基因作物生物安全性

第三節(jié)分子標(biāo)識輔助選擇育種

一、*分子標(biāo)識類型和特點

二、慣用分子標(biāo)識原理和遺傳特征

三、MAS育種方法3/479第十三章生物技術(shù)在作物育種中應(yīng)用

第一節(jié)細(xì)胞工程與作物育種4/479植物細(xì)胞工程（plantcellengineering）是以植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來一門學(xué)科。它以細(xì)胞為基本單位，在體外（invitro）條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為地使細(xì)胞一些生物學(xué)特征按人們意愿生產(chǎn)某種物質(zhì)過程。5/479細(xì)胞工程與作物遺傳改良有著親密關(guān)系，利用細(xì)胞工程技術(shù)已培育出一些大面積推廣品種。6/479

早期，哈布蘭特在前人細(xì)胞學(xué)說影響下，提出高等植物組織和器官能夠不停分割，并深入提出了植物細(xì)胞全能性（celltotipotency）理論。7/479

植物細(xì)胞全能性是植物細(xì)胞工程理論基礎(chǔ)。細(xì)胞全能性是指細(xì)胞所含有形成各種細(xì)胞類型潛在能力，也包含植物細(xì)胞經(jīng)脫分化再形成植株能力。8/47919，Hanning用蘿卜胚培養(yǎng)，取得小植株，為組織培養(yǎng)工作奠定了基礎(chǔ)。9/4791934年，White對番茄切段進(jìn)行培養(yǎng)，建立了第一個活躍生長無性繁殖系，取得了離體培養(yǎng)真正成功。

三年后，White又發(fā)覺B族維生素對培養(yǎng)物生長有主要作用。10/479

經(jīng)過幾年努力，以White為主幾位科學(xué)家建立了植物組織培養(yǎng)（plainttissueculture）綜合培養(yǎng)基，成為以后各種培養(yǎng)基基礎(chǔ)。11/479

1948年，Skoog等發(fā)覺腺嘌呤/生長素百分比是控制芽和根分化決定原因之一，這一發(fā)覺成為植物組織培養(yǎng)中控制器官形成激素模式。

Miller（1956）發(fā)覺激動素比腺嘌呤更能促進(jìn)芽形成。

12/4791958年，Stewart&Shautz從胡蘿卜根懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)分化成完整小植株，使50多年前哈布蘭特提出細(xì)胞全能性假說首次得到科學(xué)驗證，這一結(jié)果大大加速了植物組織培養(yǎng)研究發(fā)展。

1964年，Guha等從曼佗羅花藥培養(yǎng)出單倍體植株。

13/4791970年，Kameya等利用花粉培養(yǎng)取得單倍體植株。

1971年，Takebe等首次從煙草原生質(zhì)體取得再生植株；

1972年，Carlson等取得第一個煙草種間體細(xì)胞雜種植株。14/479

至此，在愈傷組織水平、單個細(xì)胞水平、單個生殖細(xì)胞水平、原生質(zhì)體水平和體細(xì)胞雜種水平都取得了完整植株，充分證實了植物細(xì)胞全能性。

植物組織培養(yǎng)流程示意圖以下。15/479

外植體起源→外植體培養(yǎng)→

愈傷組織

→再生小植株→再生植株

16/479植物細(xì)胞工程應(yīng)用在20世紀(jì)60年代就已受到重視，但真正應(yīng)用研究在70年代才進(jìn)入高潮。我國第一個用花藥培養(yǎng)育成煙草品種，隨即又育成了一些水稻、小麥新品種。17/479經(jīng)濟植物快繁與脫毒、體細(xì)胞變異篩選、新種質(zhì)創(chuàng)造、細(xì)胞器移植、DNA導(dǎo)入等均對作物改良和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起到了促進(jìn)作用。18/479一、植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)19/479（一）培養(yǎng)基及其組成

20/4791、培養(yǎng)基（Medium）種類和特點

慣用培養(yǎng)基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。21/4792、培養(yǎng)基成份

培養(yǎng)基中都應(yīng)包含植物生長必需16種營養(yǎng)元素和一些生理活性物質(zhì)，通常將這些物質(zhì)分為三大類，即無機營養(yǎng)物、有機物質(zhì)和植物生長調(diào)整物質(zhì)（表）。

22/479表

植物組織培養(yǎng)所需養(yǎng)分和激素

水↑

有機物

大量元素

微量元素

PH

糖NFeCo↓

氨基酸PZnNi

維生素KBAl

生長素CaMnMo

細(xì)胞分裂素MgCuI

調(diào)整物質(zhì)

赤霉素S

脫落酸

乙烯

酵母提取物

椰子汁

成份不定物質(zhì)

植物提取物

水解酪蛋白

蛋白胨23/479（二）培養(yǎng)基配制

24/4791、母液配制

為了降低配制培養(yǎng)基時每次稱量藥品麻煩，降低極微量藥品在每次稱重時誤差，普通先配制高濃度貯備液，即母液。25/479

大量元素可配成10倍母液，使用時每配制1000ml培養(yǎng)基需要從母液中取100ml。配制母液時應(yīng)做到分別稱量，充分溶解，在混合次序上應(yīng)最終加入Ca2+，混合時要邊加邊混合。26/479

微量元素因為使用量低，普通配成100倍甚至1000倍母液，使用時每配制1L培養(yǎng)基從母液中取10ml或1ml，配制時應(yīng)注意充分溶解后再依次混合。27/479

第三種母液即鐵鹽，鐵鹽必須單獨配制，若與其它元素混合易造成沉淀。普通采取鰲合鐵，即FeSO4與EDTA鈉鹽混合物，普通擴大200倍。28/479

EDTA鈉鹽須用溫水溶解，然后與FeSO4液混合，在75~80℃之間讓其鰲合1h。使用鰲合鐵目標(biāo)是防止沉淀，并使培養(yǎng)基能遲緩不停地供給Fe+。29/479第四種母液為有機化合物母液，主要是維生素和氨基酸類物質(zhì)，這類物質(zhì)不能配成混合母液，一定要分別配成單獨母液，濃度為每毫升含0.1、1、10mg，使用時依據(jù)需要量取。30/479

最終一個母液是激素，每種激素應(yīng)單獨配制母液，其濃度為0.1、0.5或1.0mg/ml。各種激素難溶于水，配制時應(yīng)注意溶解次序。31/479

IAA、NAA、GA3、玉米素先溶于少許95%酒精，再加水定容；NAA可溶于熱水或少許酒精后，再加水定容；2，4-D不溶于水，可用1molNaOH溶解后再定容；KT和BA應(yīng)先溶于少許1molHCl中，然后定容。32/479表

一些植物組織培養(yǎng)基成份（mg/L）

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

成份MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

大量元素

NH4NO31650--1650--720----16501200

KNO319002527.51900809502500--19001900

CaCl2?2H2O440150------20075440440

CaCl2----440--166--------

MgSO4?7H2O370246.5370750185400250370370

KH2PO4170--170--68----170340

NH4H2PO4----------340------

（NH4）2SO4--134--------------

Ca（NO3）2?4H2O------300----------

NaNO3------------600----

NaH2PO4?H2O--150--19----125----

KCl------65----750----

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------33/479------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

成份MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

微量元素

KI0.830.753.320.75--10.010.83--

H3BO36.2324.81.510516.20.63

MnSO4?4H2O22.3--89.2525--0.122.32.23

MnSO4?H2O--10------10------

ZnSO4?7H2O8.6234.4310118.6--

ZnSO4?4H2O------------------

Zn?Na2?EDTA----------------15

Na2MoO4?2H2O0.250.251.0--0.250.1--0.250.025

MoO3------0.001----------

CuSO4----------0.2------

CuSO4?5H2O0.0250.0250.10.010.025--0.030.0250.0025

CoCl2?6H2O0.0250.0250.1----0.1--0.0250.0025

CoSO4?7H2O------------0.03----

AlCl3------------------

NiCl2?6H2O------------0.03----

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------34/479---------------------------------------------------------------------------------------------------------

鐵鹽成份MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER

--------------------------------------------------------------------------------------------------------FeCl3?6H2O------------1----

Fe2(SO4)3------2.5----------

FeSO4?7H2O27.8--27.8--27.815--27.827.8

Na2EDTA?2H2O37.3--37.3--37.320--37.337.3

NaFe?EDTA--28--------1----

--------------------------------------------------------------------------------------------------------35/479成份MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER

有機物

鹽酸吡哆醇0.5110.010.50.5----0.5

鹽酸硫胺素0.110130.010.55--0.40.5

煙酸0.5110.0555----0.5

肌醇100100100--1001000--100--

甘氨酸2----32------2

脯氨酸----1381------------

葉酸--------0.5--------

生物素--------0.05--------

蔗糖3%2%3%2%2%3%--3%4%

36/4792、培養(yǎng)基配制

以配制1L培養(yǎng)基為例，培養(yǎng)基配制方法以下：

37/479

⑴

混合各成份母液。取大量元素母液100ml、微量元素母液10ml、鐵鹽母液5ml于一個1L燒杯中，依次加入有機成份和激素，并加水至500ml。38/479

⑵熔化瓊脂：稱7~8g瓊脂和所需蔗糖于另一1L燒杯中，加水至500ml，待糖溶解后，加熱使瓊脂充分熔化。39/479

⑶將（1）和（2）混合，攪拌均勻，補水至1000ml。40/479

⑷調(diào)PH。普通用0.1molNaOH或1NHCl調(diào)PH至所需PH。普通PH調(diào)至5.8，但也有PH調(diào)到7.0，不一樣材料最適PH不一樣。對培養(yǎng)基凝固來說，PH較高時，培養(yǎng)基過硬，不便于培養(yǎng)材料吸收營養(yǎng)；PH過低，低到4.0以下時，培養(yǎng)基極難凝固。41/479

⑸分裝：將培養(yǎng)基分裝于100ml或50ml三角瓶中，每瓶50或30ml左右，封口包裝。42/479

⑹滅菌：普通用1.1kg/cm2壓力，在121℃下滅菌15~20min。滅菌時間應(yīng)依據(jù)材料掌握。時間短，滅菌不徹底；時間長，會引發(fā)培養(yǎng)基成份降解。43/479

⑺放置備用。滅菌后取出培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)臺上，使之冷卻凝固。培養(yǎng)瓶應(yīng)平放，以免形成斜面。44/479（三）無菌操作方法

45/4791、消毒劑

在接種前，必須使材料完全無菌，這是取得植物組織培養(yǎng)成功基本確保。要確保這一點，取材時應(yīng)選取植物組織內(nèi)部無菌材料。從健壯植株上取材，不要有傷口；嚴(yán)格預(yù)防病蟲。46/479應(yīng)在晴天取材，最好中午或下午取材。最好防止選取田間材料，選取無菌苗很好。非要用田間材料時，為防止消毒困難，可將材料種在大棚或生長箱里。慣用消毒劑見表。47/479表

植物材料消毒慣用消毒劑及使用方法

----------------------------------------------------------------------

消毒劑

使用濃度消除難易

消毒時間消毒效果

（%）

（min）

----------------------------------------------------------------------

次氯酸鈉2易5~30很好

次氯酸鈣9~10易5~30很好

漂白粉

飽和溶液

易5~30很好

氯化汞0.1~1.0較難2~10最好

酒精 70~75 易 0.2~2 好

H2O2 10~12 最易5~15好

溴水 1~2 易 2~10很好

AgNO3 1較難5~30好

抗生素4~50mg/L中30~60 很好

48/479對于難消毒材料，如有茸毛、粗糙不平材料等，在消毒前，普通先用肥皂水洗，自來水沖凈，在70%酒精或1LHCl中浸30s，再加入消毒劑。不一樣材料消毒方式和所需時間不一樣，研究者應(yīng)依據(jù)不一樣材料確定詳細(xì)消毒方案。49/4792、無菌操作

準(zhǔn)備好接種材料用培養(yǎng)基、待消毒材料、無菌水、無菌燒杯及其它必需玻璃器皿、無菌操作工具（如剪刀、鑷子、解剖刀等，這些工具可用高溫消毒，也可用高壓高溫滅菌，也可隨用隨消毒）、70%酒精等。50/479

將超凈工作臺打開，讓其運行10min左右，在超凈工作臺上打開燒杯和無菌水瓶蓋，將HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料燒杯中，5~10min后取出另一盛有沒有菌水燒杯中，無菌水沖洗3~4次，然后將材料取出接種在培養(yǎng)基中，封口，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。51/479無菌操作時應(yīng)注意下面幾個問題：整過操作過程一切用具必須一直保持無菌狀態(tài)；無菌操作前必須用肥皂洗手，然后用70%酒精洗手；操作時無菌器皿一旦打開，應(yīng)盡可能防止手再從其上橫過；防止強呼吸，呼吸時應(yīng)將臉移開超凈臺；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，防止交叉污染。52/4793、無菌培養(yǎng)

材料接種后移入培養(yǎng)室培養(yǎng)，普通培養(yǎng)室要求非常衛(wèi)生，恒溫，有理想光照控制系統(tǒng)，普通材料要求25℃左右，晚上普通不低于20℃。53/479二、

細(xì)胞和組織培養(yǎng)與作物育種54/479（一）

體細(xì)胞克隆變異及其育種利用

55/479在近50年中，以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)生物技術(shù)研究與發(fā)展為植物育種提供了一些新試驗方法和伎倆，而且培養(yǎng)出一些在生產(chǎn)上有利用價值品種。56/479

體細(xì)胞克隆變異指植物組織和體細(xì)胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生變異。Larkin等（1981）在其綜述文章中開始使用“體細(xì)胞克隆變異”（somaclonalvariation）這一概念。57/479為了區(qū)分起源于體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞變異，Evans未來自配子體組織變異稱為“配子體克隆變異”（gametoclonalvariation），以與體細(xì)胞克隆變異區(qū)分開。58/479對于遺傳變異分析而言，Orton為了統(tǒng)一術(shù)語，引進(jìn)了R0、R1、R2等，分別表示再生當(dāng)代、自交第一代、第二代等，至今這一概念還在廣泛應(yīng)用。

59/479

1、體細(xì)胞克隆變異遺傳基礎(chǔ)

（1）染色體數(shù)目變異

最多見是多倍體，主要是培養(yǎng)基中使用了細(xì)胞分裂素。60/479

變異大小與培養(yǎng)狀態(tài)、年紀(jì)、原始材料倍性及培養(yǎng)時期相關(guān)。研究發(fā)覺：二倍體變異頻率隨培養(yǎng)時間延長而降低，四倍體變異頻率卻隨培養(yǎng)時間延長而增加。61/479（2）染色體結(jié)構(gòu)變異

染色體結(jié)構(gòu)變異似乎是體細(xì)胞克隆變異主要起源，最主要是染色體缺失、倒位、重復(fù)和異位。很多體細(xì)胞再生株減數(shù)分裂時形成多價體、染色體橋、小片段、環(huán)等，充分說明了染色體結(jié)構(gòu)變異存在。62/479（3）點突變

這類突變可分為各種類型，一個類型是自發(fā)突變，最早證實點突變存在是從煙草中利用體外篩選取得抗chlorsulfuron突變體。很多經(jīng)過細(xì)胞篩選取得抗病、抗除草劑等突變體屬于這類。63/479

另一個點突變是誘發(fā)突變，培養(yǎng)基中加入化學(xué)誘變劑或進(jìn)行誘變處理。因為培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物一直處于誘變環(huán)境條件下，所以突變終究是自發(fā)還是誘發(fā)極難搞清楚。64/479第三種點突變是基因表示及基因放大或衰減。高等植物一些基因在發(fā)育過程中受到某一環(huán)境刺激，能夠放大自己，即基因拷貝數(shù)大量增加，這意味著該基因轉(zhuǎn)錄mRNA及蛋白質(zhì)增加。最初在動物細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)覺這一現(xiàn)象，以后在植物中發(fā)覺也存在。65/479比如，對某一物質(zhì)抗性，能夠經(jīng)過逐步增加濃度方法而使細(xì)胞對該物質(zhì)抗性提升很多倍，這就是基因放大系統(tǒng)存在很好例證。一樣，也發(fā)覺植物細(xì)胞DNA丟失（衰減），如大豆懸浮系經(jīng)過較長時間培養(yǎng)，其核糖體基因丟失了1/3。66/479第四種點突變是有絲分裂交換。這種交換盡管很微弱地改變了基因次序，但仍影響基因表示。這種改變包含：某一基因拷貝丟失，某一基因拷貝重復(fù)或修復(fù)過程中基因轉(zhuǎn)變。67/479轉(zhuǎn)座因子也是造成體細(xì)胞突變原因之一，轉(zhuǎn)座子經(jīng)過插入與解離使一些基因表示受到調(diào)控。

68/479最終細(xì)胞質(zhì)基因葉綠體和線粒體基因也能發(fā)生突變。Gengenbachetal（1975）利用玉米T小種毒素篩選取得了抗T小種細(xì)胞系，這個基因已知位于胞質(zhì)中。69/479離體培養(yǎng)細(xì)胞會產(chǎn)生各種類型突變體，除抗性突變體外，還有形態(tài)性狀突變體、不育性、產(chǎn)量和品質(zhì)性狀改變等。形態(tài)變異如矮化性、葉型等，利用這些變異能夠進(jìn)行高光效育種。70/479培養(yǎng)再生植株中出現(xiàn)不育性頻率較高，但大多為核基因突變，能夠用來培育不育系。產(chǎn)量和品質(zhì)突變必須在田間經(jīng)過適當(dāng)分析才能確定。試驗室內(nèi)細(xì)胞水平突變體篩選多數(shù)在抗性突變體方面開展工作，如抗病、耐鹽、抗重金屬等。71/4792、突變體篩選

為了增加突變頻率，需要進(jìn)行誘變處理。將外植體、愈傷或懸浮系用誘變劑處理，如使用化學(xué)誘變劑，要充分洗滌后再進(jìn)入下一步工作。使用多大劑量和處理多長時間才能到達(dá)很好誘變效果，應(yīng)依據(jù)詳細(xì)試驗確定。72/479在突變體篩選中常采取兩種選擇法，即一步篩選法和多步篩選法。

一步篩選法是將培養(yǎng)物接種在含有最低全部致死劑量培養(yǎng)基上，表現(xiàn)出生長培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)移到含有抑制劑新鮮培養(yǎng)基上。73/479

能夠看出，這種方法是一次就把篩選壓設(shè)定很高，使不抗細(xì)胞（野生細(xì)胞）完全不可能生長，篩選出能生長細(xì)胞即為耐（抗）性細(xì)胞系。74/479但在有些情況下這種方法不一定實用，有細(xì)胞在超出最低全部致死濃度時，細(xì)胞均死亡，或單個細(xì)胞不能生存。多步篩選法是首先使用半致死劑量對細(xì)胞進(jìn)行篩選，每次繼代將上代能生長細(xì)胞系繼代到篩選劑濃度提升新鮮培養(yǎng)基上。75/479

在這種篩選體制下，抗性細(xì)胞應(yīng)該比野生細(xì)胞長快，經(jīng)過逐步增加篩選劑水平，最終會篩選出在抑制劑超出最低全部致死濃度時也能旺盛生長細(xì)胞系。76/479不過，去除抑制劑后，抗性培養(yǎng)物穩(wěn)定性是常出現(xiàn)一個問題，抗性丟失來自很多原因，包含細(xì)胞對抑制劑生理適應(yīng)。可見，多步篩選易取得在某一抑制劑水平下，細(xì)胞穩(wěn)定生長細(xì)胞系。77/479篩選材料對象能夠是原生質(zhì)體、愈傷塊、懸浮培養(yǎng)物和花粉/小孢子培養(yǎng)物。利用原生質(zhì)體進(jìn)行抗性篩選有一大優(yōu)點：篩選出克隆極有可能來自單細(xì)胞，不過操作困難。78/479利用愈傷塊篩選是最簡單方法，但這種篩選存在一定缺點，愈傷塊里各個細(xì)胞不能均等地接觸抑制劑，下部愈傷細(xì)胞比上部細(xì)胞吸收到較多抑制劑，這么就使篩選結(jié)果在一定程度上失去可靠性。79/479懸浮細(xì)胞篩選也很慣用，細(xì)胞接觸選擇劑較均勻，但存在一定操作復(fù)雜性。花粉/小孢子培養(yǎng)物用于突變體篩選有一定優(yōu)勢，突變體很輕易表現(xiàn)出來，也很易純合。

80/4793、在作物改良上應(yīng)用

利用上述方法便可篩選體細(xì)胞克隆變異，將這一技術(shù)應(yīng)用于作物改良技術(shù)路線見圖。

81/479優(yōu)良品種

↓

細(xì)胞培養(yǎng)

R0

↓

R1群體

↓

改良體細(xì)胞克隆

確定遺傳方式

↓

田間試驗

遺傳穩(wěn)定性測試

↓

多點田間試驗

育成新品系

↓

繼續(xù)田間試驗，種子富集

區(qū)域試驗

↓

審

定

↓

投入生產(chǎn)

圖

利用體細(xì)胞克隆變異育種技術(shù)路線82/479（二）

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種利用83/4791、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)在遺傳和育種中應(yīng)用價值

花藥培養(yǎng)（antherculture）是指在取得單倍體一個技術(shù)，之后，花粉和小孢子培養(yǎng)逐步取得成功，從而使單倍體細(xì)胞培養(yǎng)體系愈加完善。單倍體在遺傳和育種研究中有以下優(yōu)點：84/479（1）后代快速純合

經(jīng)過單倍體快速產(chǎn)生純系。在異花授粉作物中，可用單倍體產(chǎn)生加倍單倍體（DH系），從中篩選純合自交系用于雜交制種。因為加速純合，從而就縮短了育種周期（圖）。

85/479

母本

×

父本

↓

F1→

花藥培養(yǎng)

↓

↓

F2

花粉植株

↓

↓

↓

加倍

↓

↓

品系比較試驗

←

選擇判定

↓

區(qū)域試驗

圖雜交育種與單倍體育種周期比較86/479（2）提升選擇效率

假如某一性狀受一對基因控制，在AA×aaF2中，純合AA個體只有1/4。如F1采取花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生后代中AA個體占1/2，比常規(guī)雜交育種提升一倍。87/479（3）排除雜種優(yōu)勢對后代選擇干擾

對于雜交育種來講，因為低世代很多基因位點尚處于雜合狀態(tài)，會有不一樣程度雜種優(yōu)勢表現(xiàn)，對個體選擇會造成一定誤差。采取DH群體進(jìn)行選擇育種，因為各基因位點在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到變異能更大程度上代表真實變異。88/479（4）遺傳研究良好材料體系

單倍體是基因互作檢測、遺傳變異估計、連鎖群構(gòu)建、QTL預(yù)計及定位等數(shù)量遺傳學(xué)良好材料。尤其是近代分子生物學(xué)發(fā)展，DH系成為分子標(biāo)識作圖良好群體，它在一定程度上成為一個永久BC或F2群體。89/479（5）突變體篩選

因為單倍體各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很輕易表現(xiàn)出來，從而大大提升了抗性或其它突變體篩選效率，利用這一體系取得各種突變體事例已很多，這里就不一一贅述。90/4792、離體培養(yǎng)條件下小孢子發(fā)育

小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體小孢子，然后經(jīng)單核早期、單核靠邊期、雙核期（一個營養(yǎng)核和一個生殖核），最終抵達(dá)三核期而成為成熟花粉粒。在離體培養(yǎng)條件下，花粉正常發(fā)育路徑受到抑制。91/4793、影響花藥培養(yǎng)原因

（1）供體植株生長條件

供體植株生長條件對培養(yǎng)效果有主要影響，有時只有在控溫、一定光周期和光強條件下，其花藥才能有反應(yīng)。環(huán)境條件對于不一樣植物種有很大不一樣，所以沒有一個固定環(huán)境控制模式。92/479（2）供體植株年紀(jì)

供體植株對培養(yǎng)效果也有一定影響，普通講，開花早期植株花蕾易于培養(yǎng)。

93/479（3）花粉發(fā)育時期

用于培養(yǎng)花蕾，其花藥內(nèi)小孢子發(fā)育時期對培養(yǎng)效果有較大影響，但因物種而異。在煙草中，處于第一次有絲分裂期花粉效果最好，而在禾本科和蕓苔屬中，單核早期最好。

94/479

（4）花蕾和花藥預(yù)處理

對于有些物種，培養(yǎng)前對花藥和花蕾進(jìn)行預(yù)處理，能顯著提升培養(yǎng)效果。如大麥花藥，4℃處理28d，或7℃處理14d，能收到最好效果。可對整穗、小穗、甚至分離花藥施加預(yù)處理，只要注意處理期間不要與水接觸。也有些人將花藥接種后放在低溫下預(yù)處理，不一樣材料需不一樣預(yù)處理方式，沒有一個固定模式。95/479

（5）培養(yǎng)基終究使用固體或液體培養(yǎng)基應(yīng)依據(jù)培養(yǎng)材料要求定。多數(shù)情況下，MS、N6及馬鈴薯提取液培養(yǎng)基在禾谷類作物中用較多。花藥培養(yǎng)時往往需要一定滲透壓，有要求低濃度蔗糖（2%~4%），有要求高濃度蔗糖（8%~12%）。96/479二細(xì)胞結(jié)構(gòu)成熟花粉往往需低濃度糖，而三細(xì)胞結(jié)構(gòu)成熟花粉植物往往需高滲條件，如油菜小孢子培養(yǎng)時，糖濃度可用到13%~17%。培養(yǎng)基中所添加維生素和激素對培養(yǎng)效果可產(chǎn)生主要影響。對于一些植物種來講，添加某種植物提取物或椰汁能夠改進(jìn)培養(yǎng)效果。97/479（6）培養(yǎng)條件

多數(shù)植物在25℃下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織，可一些植物，尤其是蕓苔屬，在高溫35℃下處理幾天，然后進(jìn)入25℃培養(yǎng)能收到最好效果?；ㄋ幣囵B(yǎng)普通在暗處進(jìn)行，直到愈傷或胚狀體形成再轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。另外，接種花藥外植體置向、培養(yǎng)密度等有時對培養(yǎng)效果也有影響。98/4794、花粉（小孢子）培養(yǎng)

花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)技術(shù)。其優(yōu)點在于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)后經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成小植株都是單倍體植株或雙單倍體，不含藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織干擾而形成體細(xì)胞植株，但它培養(yǎng)難度大。99/4795、單倍體誘導(dǎo)中存在問題

對于多數(shù)植物來講，能形成有活力胚花藥百分率很低，除此之外，還有很多問題存在。100/479通?；ㄋ幓蚧ǚ垭x體培養(yǎng)時沒有生長和發(fā)育跡象，或剛開始生長便造成胚敗育；在產(chǎn)生單倍體同時產(chǎn)生二倍體或四倍體；培養(yǎng)中我們需要小孢子分裂，而二倍體組織不分裂，但這種情況往往難以辦到；白化苗難以防止，尤其是在禾本科作物中；在混倍性材料中極難分離出單倍體，因為單倍體細(xì)胞生長很易被生長旺盛多倍體細(xì)胞所掩蓋。101/4796、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)與植物育種

單倍體是高度不育，需要進(jìn)行加倍處理才能應(yīng)用。秋水仙素是慣用染色體加倍藥劑，能夠用1%秋水仙素對正處于對數(shù)生長久懸浮細(xì)胞進(jìn)行處理，普通24h左右。也可在固體培養(yǎng)基中加適當(dāng)濃度秋水仙素。102/479

花粉植株在培養(yǎng)過程中能夠自然加倍，但頻率很低。將單倍體植株組織或器官用作外植體，重新誘導(dǎo)愈傷組織，讓培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自然加倍也是一個方法。103/479A品種

×B品種

↓

F1雜交種

↓小孢子培養(yǎng)或花藥培養(yǎng)

單倍體培養(yǎng)

↓染色體加倍

重組純合系

↓選擇

重組了A和B品種優(yōu)點純系

↓自交、田間測試

遺傳穩(wěn)定性測試

↓田間測試

新品系→→→→→確定遺傳基礎(chǔ)

↓品種親本

↓-------------------------------雜交

推廣利用↓雜種優(yōu)勢利用

圖單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種技術(shù)104/479（三）幼胚培養(yǎng)與遠(yuǎn)緣雜交育種

105/479植物胚胎培養(yǎng)（embryoculture）是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在離體無菌培養(yǎng)條件下發(fā)育成幼苗技術(shù)。植物幼胚和胚珠培養(yǎng)是植物遠(yuǎn)緣雜交育種主要輔助伎倆。106/479（四）種質(zhì)長久保留107/479細(xì)胞培養(yǎng)和莖尖培養(yǎng)再生植株技術(shù)實現(xiàn)為離體試管保留種質(zhì)提供了條件，這種方法只需要較少空間就能保留大量無性系，而且保留過程中可防止病蟲害侵襲，在特定條件下能夠長久保留，需要時候只需將材料取出來快速繁殖即可。108/479保留材料能夠是各種類型，依植物材料性質(zhì)和需要定。材料能夠是愈傷組織、莖尖、幼胚、花粉形成單倍體愈傷組織等。

109/479保留方法主要有遲緩生長保留法和超低溫保留法。對于生長遲緩材料，在常規(guī)培養(yǎng)條件下就能保留很長時間，但大多數(shù)植物離體培養(yǎng)時需要頻繁繼代，需要經(jīng)過降低生長速度來延長繼代間隔。110/479遲緩生長法主要是基于改變培養(yǎng)環(huán)境和修改培養(yǎng)基來實現(xiàn)對種質(zhì)資源進(jìn)行短期和中期保留。遲緩生長法保留技術(shù)包含降低培養(yǎng)溫度、降低氧氣含量、將組培材料脫水干燥等。111/479超低溫保留法能夠長久保留植物材料，不需要繼代，其原理是在超低溫情況下，使生物代謝和衰老過程大大減慢甚至完全停頓。112/479超低溫通常指低于-80℃低溫，保留介質(zhì)或容器有干冰（-79℃）、超低溫冰箱（-80—150℃）、液氮（-196℃）和液氮蒸汽相（-140℃）等，其中液氮最慣用。113/479超低溫保留與遲緩生長保留法相比，含有一定技術(shù)復(fù)雜性，使用時應(yīng)依據(jù)詳細(xì)材料和相關(guān)文件確定技術(shù)方案。114/479（五）脫毒及繁殖主要品種或材料

115/479多數(shù)作物，尤其是無性繁殖作物，因為病毒或其它病原菌侵襲，有一個產(chǎn)量和品質(zhì)下降過程，經(jīng)常需要對受病毒侵染材料進(jìn)行脫毒處理。病毒在植物體內(nèi)分布是不均勻，在受侵染植株中，頂端分生組織普通不帶毒，或只攜帶濃度很低病毒。116/479因為存在這一規(guī)律，我們便可利用莖尖培養(yǎng)方法使植物脫去病毒。植物莖尖脫毒在無性繁殖作物提純復(fù)壯中有很主要應(yīng)用價值，如馬鈴薯、甘薯、果樹、多年生花卉等。117/479組織培養(yǎng)在植物快速繁殖中有很好用途。大多數(shù)果樹和觀賞植物是高度雜合，它們種子后代無法與原品種相同，在這種情況下，如要保持原種特征，需利用莖尖培養(yǎng)快速繁殖。另外，莖尖培養(yǎng)在保留稀有野生資源、繁殖不育遠(yuǎn)緣雜種等方面含有優(yōu)勢。118/479植物材料快速繁殖主要是經(jīng)過誘導(dǎo)莖芽形成實現(xiàn)，能夠經(jīng)過兩種路徑使莖芽增殖。一個是經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽形成，然后分株培養(yǎng)，便可取得大量遺傳上基本一致無性系。119/479另一個是誘導(dǎo)莖尖或不定芽萌發(fā)或形成叢生芽也可到達(dá)快速繁殖目標(biāo)。一些腋芽、植物器官或節(jié)段起源芽，普通處于休眠狀態(tài)，經(jīng)過離體培養(yǎng)可解除休眠而萌發(fā)。植物脫毒與快速繁殖技術(shù)很易使一些作物，如甘薯、果樹、經(jīng)濟林木等形成產(chǎn)業(yè)化，創(chuàng)造顯著經(jīng)濟價值。120/479（六）人工種子生產(chǎn)121/479

人工種子（artificialseeds）是指將細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生體細(xì)胞胚或其類似物，經(jīng)過有機化合物包埋而形成能在適宜條件發(fā)芽類似于天然植物種子顆粒體。它通常由三部分組成：體細(xì)胞胚、人工胚乳、人工種皮。122/479人工種子研究在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有主要意義，它在固定雜種優(yōu)勢、快速繁殖良種和不育材料、節(jié)約用種、工廠化生產(chǎn)種子方面都有潛在價值。對木本植物來說，用人工種子可無須等候漫長有性世代，即能夠快速繁殖優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)基因植物推廣到生產(chǎn)上去。另外，人工種子體積小，便于運輸。123/479三、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交124/479植物原生質(zhì)體（protoplast）是一個沒有壁細(xì)胞，因為沒有壁及質(zhì)膜暴露在外界環(huán)境下，使原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)變得很脆弱，在沒有一定滲透劑和穩(wěn)定劑情況下，很快會破裂。因為上述特點，使得原生質(zhì)體操作難度較大，可一旦再生了壁就恢復(fù)了細(xì)胞全能性，含有了同正常細(xì)胞一樣特征。125/479（一）原生質(zhì)體分離

126/479原生質(zhì)體分離最基本標(biāo)準(zhǔn)是確保原生質(zhì)體不受傷害及不損害它再生能力，其先決條件是要有一個適當(dāng)滲透壓。

127/4791、分離方法

分離原生質(zhì)體方法普通有機械分離和酶法分離兩種。128/479

機械法分離是早期采取分離方法，先對材料進(jìn)行質(zhì)壁分離處理，然后切割，這一過程中會釋放出少許不受損傷原生質(zhì)體。用這一方法僅能從液泡很大材料中取得原生質(zhì)體，而不能應(yīng)用于分生細(xì)胞。129/479酶法分離原生質(zhì)體是當(dāng)前慣用方法，可分為一步法和二步法。

一步法是將果膠酶（pectinase）和纖維素酶（celluluse）等混合處理材料，直接分離取得原生質(zhì)體。130/479二步法是先用果膠酶處理材料，降解細(xì)胞間層使細(xì)胞分離，再用纖維素酶水解胞壁釋放原生質(zhì)體。當(dāng)前多用一步法。131/4792、影響原生質(zhì)體分離原因

（1）材料起源

葉肉細(xì)胞是慣用材料，因為葉片很輕易取得而且能充分供給，其次為愈傷細(xì)胞或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。從葉片起源原生質(zhì)體在遺傳上較一致，而培養(yǎng)細(xì)胞起源原生質(zhì)體則不然，因為培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生變異。132/479但由愈傷或懸浮系起源原生質(zhì)體，能夠防止植株生長環(huán)境不良影響，還能夠常年供給，易于控制新生細(xì)胞年紀(jì)，處理時操作簡便，無需消毒。另外，從根、莖、葉、花、果實、胚芽鞘、子葉、花粉、四分體等均能分離原生質(zhì)體。133/479（2）滲透壓原生質(zhì)體分離之前必須確定一個適合滲透壓。在這種滲透壓下，原生質(zhì)體分離、純化過程中都不致使原生質(zhì)體受損傷。134/479（3）酶植物細(xì)胞壁是一個復(fù)雜結(jié)構(gòu)，由纖維素和半纖維素組成，需要一定酶組成才能降解它。廣泛使用商品酶制劑能夠從很多企業(yè)購置。135/479（4）分離培養(yǎng)基Ca2+對原生質(zhì)體產(chǎn)量和穩(wěn)定性有很大影響，它是細(xì)胞壁主要成份，同時能穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)。另外，Mg2+、PO43-對于原生質(zhì)體活力保持也有主要作用，所以分離原生質(zhì)體培養(yǎng)基中除酶外，普通含這些離子。136/479（5）培養(yǎng)條件酶處理時溫度和pH最主要。PH使用范圍為4.8-7.2，可是，高pH（大于6.0）普通有利于原生質(zhì)體生存，可能是高pH降低了細(xì)胞壁降解時產(chǎn)生有害酶活性和存在于分離培養(yǎng)基中毒性物質(zhì)活性。為了預(yù)防pH改變，常加入MES[2（N-morpholino）-ethanesulfonicacid]。這是一個緩沖劑，普通使用量為3mM。137/479

分離原生質(zhì)體培養(yǎng)時間與溫度成反比，可是，高溫下短時間分離原生質(zhì)體不適于培養(yǎng)，它們易發(fā)褐和破裂。慣用溫度為23-32℃。有材料溫度很低，5-10℃。也有高、低溫結(jié)合使用。酶處理時普通在暗處培養(yǎng)，但有些材料在光下有利。培養(yǎng)過程中，間斷低速震蕩有利于酶滲透。138/479（6）組織前處理高滲前處理、激素處理、低溫處理、激素與低溫結(jié)合前處理等對不一樣植物原生質(zhì)體分離可能有很好效果。

139/4793、原生質(zhì)體搜集、純化和活力測定

原生質(zhì)體酶解完成后，將其用200目篩過濾，濾液再用400目過濾，搜集濾液，低速離心，去上清液。用含有酶解液一樣滲透劑無酶CPW液將原生質(zhì)體懸起，再離心，去上清，重復(fù)幾次，便完成原生質(zhì)體洗滌工作。140/479原生質(zhì)體純化可采取蔗糖懸浮法、梯度離心法或二相界面法，詳細(xì)操作方法可參考專業(yè)書籍。用Evan’sblue或FDA測定原生質(zhì)體活力，以確定原生質(zhì)體分離效果。141/479（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)

142/479原生質(zhì)體培養(yǎng)前必須調(diào)到一定密度，普通103-105/ml密度比較適合原生質(zhì)體培養(yǎng)。原生質(zhì)體培養(yǎng)方法各種各樣，依作物和材料起源而異。平板培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、液-固雙層培養(yǎng)、瓊脂糖包埋、看護(hù)培養(yǎng)等是原生質(zhì)體培養(yǎng)慣用方法。143/479但不論哪種培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)過程中，都應(yīng)依據(jù)細(xì)胞生長情況不停降低滲透壓。待肉眼可見細(xì)胞團形成后，便可轉(zhuǎn)移到普通細(xì)胞培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)胞繁殖和分化工作。144/479影響原生質(zhì)體培養(yǎng)原因很多，物理條件如密度、光照和溫度等都會影響培養(yǎng)效果。低于一定密度原生質(zhì)體不能分裂，普通認(rèn)為大群體原生質(zhì)體有利于將培養(yǎng)基中原生質(zhì)體在培養(yǎng)過程中釋放有害物質(zhì)脫毒。145/479原生質(zhì)體培養(yǎng)普通在暗處進(jìn)行，有利于壁形成和細(xì)胞再生，有物種一直在暗處直到形成愈傷組織，有一周后移到光下。146/479原生質(zhì)體培養(yǎng)普通在22-25℃進(jìn)行，高、低溫都有害。但有植物要求27-30℃，在25℃時不能形成愈傷組織。147/479原生質(zhì)體比細(xì)胞需要更復(fù)雜培養(yǎng)條件，有時需要在有喂養(yǎng)層細(xì)胞情況下原生質(zhì)體才能再生。培養(yǎng)基無機營養(yǎng)和有機營養(yǎng)組成都對培養(yǎng)效果有顯著影響。148/479選擇適當(dāng)滲透壓對于取得大量原生質(zhì)體并保持其活力均很主要，普通用甘露醇或山梨醇調(diào)整滲透壓。在培養(yǎng)過程中普通需降低滲透壓以促進(jìn)分裂。149/479對于瓊脂糖包埋培養(yǎng)，可將其切成小塊，轉(zhuǎn)移到低滲液體培養(yǎng)基中漂浮培養(yǎng)，液體培養(yǎng)則可加入低滲一定體積培養(yǎng)基，但普通每一步降低程度不超出25%?，F(xiàn)在一個趨勢是將蔗糖或葡萄糖單獨使用或與甘露醇結(jié)合作為穩(wěn)定劑，一旦糖被降解，培養(yǎng)基滲透壓降低，利于細(xì)胞分裂。150/479生長素對于培養(yǎng)早期壁形成是需要，最慣用是2，4-D，有時需要生長素與分裂素結(jié)合使用。生長素使用量一定要小心確定，因為它很輕易使液泡長大或增加新液泡而使細(xì)胞分裂。151/479試驗證實，生長素經(jīng)過調(diào)整一些特異mRNA合成而起作用。分裂誘導(dǎo)后，需要轉(zhuǎn)到低生長素條件下才能促進(jìn)細(xì)胞生長。另外，維生素、水解酪蛋白、椰汁等，對原生質(zhì)體生長有促進(jìn)作用。在培養(yǎng)過程中也需注意一些氨基酸使用。152/479原生質(zhì)體形成愈傷團后，便可采取常規(guī)愈傷組織培養(yǎng)方法使細(xì)胞擴大繁殖或分化形成植株。

153/479（三）細(xì)胞融合（體細(xì)胞雜交）

物種間生殖隔離妨礙了物種間基因交流，從而給作物育種帶來很大不足。原生質(zhì)體融合技術(shù)是實現(xiàn)基因重組一條路徑，當(dāng)前利用細(xì)胞融合已從很多作物種、屬間，甚至科間取得雜種體細(xì)胞雜種，創(chuàng)造了一些自然界不存在植物類型，有效地拓寬了植物育種資源。154/4791、融合方法

分離原生質(zhì)體不帶電荷，它們相互排斥，所以普通要在誘發(fā)條件下才能發(fā)生融合。異種原生質(zhì)體首先發(fā)生膜接觸，然后兩個原生質(zhì)體形成細(xì)胞質(zhì)橋，最終兩種細(xì)胞質(zhì)將兩個核包圍起來而完成融合。慣用融合方法簡單介紹以下：155/479（1）NaNO3處理誘發(fā)融合

由NaNO3誘導(dǎo)可重復(fù)、控制離體原生質(zhì)體融合是由Power等（1970）報道。利用這一融合劑，Carlson等（1972）即使在植物中取得了第一個體細(xì)胞雜種，但這種方法存在嚴(yán)重缺點就是融合頻率低，而且對于起源于葉肉高度液泡化原生質(zhì)體有害。這種融合機制普通認(rèn)為是Na+造成了膜電位改變。156/479（2）高pH—高濃度鈣離子處理

煙草葉肉原生質(zhì)體在高Ca2+（0.05MCaCl2）和高pH（10.5）條件下能很快誘發(fā)融合（37℃），但融合頻率不很高，高pH也影響原生質(zhì)體存活率，且易誘發(fā)多個原生質(zhì)體融合。高Ca2+高pH誘發(fā)融合機制尚不很清楚，普通認(rèn)為是改變了膜位及膜物理結(jié)構(gòu)。157/479

（3）PEG（聚乙二醇）處理

PEG誘導(dǎo)不但融合頻率高，而且使二核融合頻率增加且無特異性。PEG是一個高分子量多聚體（1500—6000），25%—50%PEG可立刻刺激原生質(zhì)體引發(fā)收縮，隨即發(fā)生聚集。PEG誘發(fā)融合后應(yīng)逐步去除。影響原生質(zhì)體聚集及隨即融合因子很多，如PEG分子量及濃度、原生質(zhì)體材料起源、分離原生質(zhì)體時使用酶制劑、離子種類和濃度、融合溫度等。158/479

（4）電融合當(dāng)兩個原生質(zhì)體處于接觸狀態(tài)時，給一個5—12μamp電流連續(xù)1—5s，原生質(zhì)體首先受刺激，然后馬上融合。應(yīng)用電融合時，原生質(zhì)體輕微收縮，表明其膜狀態(tài)有一個短暫改變。159/479電融合包含兩個步驟：

①電泳：在電極作用下，原生質(zhì)體泳到一起，建立一個膜接觸狀態(tài)，形成念珠鏈。

②融合：因為膜可逆性電激穿，使原生質(zhì)體發(fā)生融合。160/479

原生質(zhì)體融合很受重視，因為它防止了化學(xué)物質(zhì)潛在毒害。融合率與原生質(zhì)體起源、體積、念珠鏈長度、脈沖連續(xù)時間及電壓等原因相關(guān)。在融合時應(yīng)注意一個問題，即電刺激會造成液泡中一些毒性物質(zhì)滲漏，影響原生質(zhì)體活力。假如能用一個方法將液泡分離出來，再誘導(dǎo)融合很好。161/4792、融合方式

原生質(zhì)體融合有兩種融合方式，即對稱融合和非對稱融合。這兩種融合方式都能產(chǎn)生三種類型雜種：綜合了雙親全部遺傳物質(zhì)對稱雜種；部分遺傳物質(zhì)發(fā)生丟失非對稱雜種；只含有融合雙親一方核遺傳物質(zhì)胞質(zhì)雜種。162/479

對稱融合即雙親核質(zhì)組裝在一起融合。

非對稱融合指在融合前對一方親本原生質(zhì)體施加一定處理，純化其細(xì)胞質(zhì)，再和另一方原生質(zhì)體融合，從而得到非對稱雜種或胞質(zhì)雜種。163/479

對稱融合也可取得這兩種雜種，因為一方染色體會發(fā)生丟失。在進(jìn)行非對稱融合前，需要對供體和受體進(jìn)行處理。對供體進(jìn)行處理目標(biāo)主要是造成染色體斷裂和片段化，從而使供體染色體進(jìn)入受體后部分或全部丟失，到達(dá)轉(zhuǎn)移部分遺傳物質(zhì)或只轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因組目標(biāo)。164/479

對供體進(jìn)行處理方法有各種：射線（X、γ和紫外線）輻射原生質(zhì)體；限制性內(nèi)切酶處理原生質(zhì)體；紡錘體毒素、染色體濃縮劑處理原生質(zhì)體，其中射線作用最好。

165/479為了降低融合后再生后代篩選工作，研究者利用一些代謝抑制劑處理受體原生質(zhì)體以抑制其分裂。慣用抑制劑有碘乙酸（IA）、碘乙酰氨（IOA）和羅丹明（R-6-G）。166/479R-6-G抑制線粒體氧化磷酸化，IA、IOA能夠抑制線粒體氧化磷酸化或糖酵解過程，從而不能為細(xì)胞生長和發(fā)育提供能量。受IA、R-6-G和IOA處理細(xì)胞和非代謝抑制劑處理細(xì)胞（供體，核鈍化，但線粒體正常）發(fā)生融合后，代謝上就會得到互補，從而能正常地生長。167/4793、雜種細(xì)胞篩選

原生質(zhì)體融合后，必須有一個可行方法分離出融合雜種，假如培養(yǎng)條件只允許雜種細(xì)胞生長，而不允許親本細(xì)胞生長當(dāng)然最好。雜種細(xì)胞篩選很主要，因為原生質(zhì)體密度很高，親本原生質(zhì)體生長很快掩蓋雜種細(xì)胞生長，除非雜種細(xì)胞了含有生長優(yōu)勢。慣用雜種細(xì)胞篩選體系有以下幾個：168/479（1）形態(tài)互補利用兩種原生質(zhì)體形態(tài)色澤上差異，在融合處理后，分別接種在帶有小格培養(yǎng)皿中，每個小格中約有2—3個原生質(zhì)體。在顯微鏡下能夠找出異源融合體并標(biāo)定位置。169/479（2）遺傳互補利用兩個白化突變互補可以進(jìn)行篩選。單個隱性突變性狀（如白化）可以與某一形態(tài)性狀結(jié)合起來用于篩選。如Daucuscarota是一白化突變，D.capillifolius是正常體但再生率很低，將上述兩種原生質(zhì)體融合后，綠色愈傷組織多為雜種細(xì)胞形成。然后再結(jié)合形態(tài)及染色體數(shù)目檢查就可進(jìn)一步證實。170/479

（3）代謝互補利用兩種營養(yǎng)缺點型或兩種抗性突變體原生質(zhì)體進(jìn)行融合，在同時缺點兩種物質(zhì)或同時含有兩種有害物質(zhì)培養(yǎng)基上篩選雜種細(xì)胞，能生長細(xì)胞團能夠初步認(rèn)為由雜種細(xì)胞形成。

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（4）生長互補Carlson等（1972）發(fā)覺，雙親原生質(zhì)體生長需要外源生長激素，而由雙親原生質(zhì)體融合后形成對生長激素自主雜種細(xì)胞，能在無外源生長激素培養(yǎng)基上生長。用這一特點選出了粉藍(lán)煙草與郎氏煙草體細(xì)胞雜種。172/4794、雜種判定

經(jīng)過雜種細(xì)胞篩選取得再生植株不一定是雜種植株，應(yīng)經(jīng)過深入驗證才能確定。有各種判定雜種方法。依據(jù)形態(tài)性狀判斷是最簡單方法，雜種植株葉形通常介于雙親之間，葉面積居中，花器官（花冠長度、顏色、形態(tài)等）帶有雙親性狀。173/479

染色體計數(shù)是細(xì)胞學(xué)判定體細(xì)胞雜種基本方法，但雜種染色體數(shù)目不一定恰好是雙親染色體數(shù)目之和，常出現(xiàn)混倍體。染色體數(shù)目標(biāo)改變可能來自多細(xì)胞融合、培養(yǎng)過程中細(xì)胞學(xué)變異和核與質(zhì)基因融合后不親和。174/479

慣用生化判定方法是同工酶，融合后形成雜種應(yīng)該表現(xiàn)出雙親同工酶帶型。分子標(biāo)識判定能夠較準(zhǔn)確地反應(yīng)融合是否成功，RAPD、RFLP、AFLP是慣用判定雜種分子標(biāo)識。175/4795、細(xì)胞融合與作物育種

利用細(xì)胞融合能夠克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，創(chuàng)造種間、屬間雜種，為作物育種提供新材料。176/479不過，細(xì)胞融合獲得雜種一般在生產(chǎn)上難以直接利用，但這一技術(shù)可認(rèn)為作物育種創(chuàng)造自然界不存在新資源，對作物育種種質(zhì)資源拓展有十分重要意義。177/479第二節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種

178/479作物轉(zhuǎn)基因育種就是依據(jù)育種目標(biāo)，從供體生物中分離目標(biāo)基因，經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運載進(jìn)入受體作物，經(jīng)過篩選取得穩(wěn)定表示遺傳工程體，并經(jīng)過田間試驗與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。179/479作物轉(zhuǎn)基因育種包括目標(biāo)基因分離與改造、載體構(gòu)建及其與目標(biāo)基因連接等DNA重組技術(shù)；經(jīng)過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍轟擊等方法使重組體進(jìn)入受體細(xì)胞或組織以及轉(zhuǎn)化體篩選、判定等遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和相配套組織培養(yǎng)技術(shù)；取得攜帶目標(biāo)基因轉(zhuǎn)基因植株（遺傳工程體）；遺傳工程體在有控條件下安全評價以及大田研究直至育成品種。180/479與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高，不過含有常規(guī)育種所不具備優(yōu)勢。主要表達(dá)在：181/479

⑴轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)體系建立使可利用基因資源大大拓寬。實踐表明，從動物、植物、微生物中分離克隆基因經(jīng)過轉(zhuǎn)基因方法可使其在三者之間相互轉(zhuǎn)移利用。182/479⑵轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗，適應(yīng)各種不良環(huán)境條件優(yōu)良品種提供了嶄新育種路徑。這既可大大降低殺蟲劑、殺菌劑使用，有利于環(huán)境保護(hù)，也能夠提升作物生產(chǎn)能力、擴大作物品種適應(yīng)性和種植區(qū)域。183/479⑶利用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)能夠?qū)χ参锬繕?biāo)性狀進(jìn)行定向變異和定向選擇，同時伴隨對基因認(rèn)識不停深入和轉(zhuǎn)基因技術(shù)伎倆完善，對多個基因進(jìn)行定向操作也將成為可能，這在常規(guī)育種中是難以想象。184/479⑷利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠大大提升選擇效率，加緊育種進(jìn)程。另外，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因方法，還可將植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥品等生物制品。正是因為轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種含有上述優(yōu)勢，使得轉(zhuǎn)基因技術(shù)從發(fā)覺到如今僅30多年歷史就得到了快速發(fā)展。185/479一、

作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)

186/479（一）轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展現(xiàn)實狀況

187/4791、國際轉(zhuǎn)基因植物研究與現(xiàn)實狀況

自從20世紀(jì)70年代重組DNA技術(shù)創(chuàng)建到1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草取得以來，至今已經(jīng)有35個科120種植物轉(zhuǎn)基因取得成功。先后有30多個國家同意了4000多例田間試驗和種植了商品化轉(zhuǎn)基因植物，包括植物種類有40各種。188/479表

世界各