綜述：細(xì)胞凋亡

綜述：細(xì)胞凋亡人體內(nèi)的細(xì)胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡則是病理性的，有關(guān)細(xì)胞死亡過程的研究，近年來已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，到目前為此，人們已經(jīng)知道細(xì)胞的死亡起碼有兩種方式，即細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡。細(xì)胞壞死是早已被認(rèn)識到的一種細(xì)胞死亡方式，而細(xì)胞凋亡則是近年逐漸被認(rèn)識的一種細(xì)胞死亡方式，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展對多種細(xì)胞凋亡的過程有了相當(dāng)?shù)恼J(rèn)識，但是迄今為止凋亡過程確切機(jī)制尚不完全清楚。而凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系。如腫瘤、自身免疫性疾病等，能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡的因素很多，如射線、藥物等。細(xì)胞凋亡的研究歷史1．凋亡概念的形成1965年澳大利亞科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎鼠門靜脈后，電鏡觀察到肝實(shí)質(zhì)組織中有一些散在的死亡細(xì)胞這些的溶酶體并未被破壞，顯然不同于細(xì)胞壞死。這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集從其周圍的組織中脫落并被吞噬機(jī)體無炎癥反應(yīng)。1972年Kerr等三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞凋亡的概念，宣告了對細(xì)胞凋亡的真正探索的開始，在此之前，關(guān)于胚胎發(fā)育生物學(xué)、免疫系統(tǒng)的研究，肝細(xì)胞死亡的研究都為這一概念的提出奠定了基礎(chǔ)。2．細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)研究階段：（1972-1987）1） 利用光鏡和電鏡對形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)的研究。2） 染色體DNA的降解：細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著特征就是細(xì)胞染色質(zhì)的DNA降解。3） RNA/蛋白質(zhì)大分子的合成。4） 鈣離子變化，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高是細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個(gè)重要條件。5） 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶：細(xì)胞發(fā)生凋亡是需要這種核酸內(nèi)切酶參與的。3．細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)研究階段，最近幾年1） 與細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因及調(diào)控2） 細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)3） 與細(xì)胞凋亡的各種分子及其相互作用及相互關(guān)系4．細(xì)胞凋亡的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究階段細(xì)胞凋亡的研究，其生命力在于最終能夠有利于疾病機(jī)制的闡明，以及新療法的探索及問世。細(xì)胞凋亡的一般概念細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡過程。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，就象樹葉或花的自然凋落一樣，對于這種生物學(xué)觀察，借用希臘?quot;Apoptosis"來表示，意思是象饕痘蚧0淖勻壞蚵洌梢胛赴蟯觥?BR>1.胞凋亡與細(xì)胞程序性死亡（PCD）其實(shí)從嚴(yán)格的詞學(xué)意義上來說，細(xì)胞程序性死亡與細(xì)胞凋亡是有很大區(qū)別的。細(xì)胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是個(gè)功能性概念，描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。例如蝌蚪變成青蛙，其變態(tài)過程中尾部的消失伴隨大量細(xì)胞死亡，高等哺乳類動(dòng)物指間蹼的消失、顎融合、視網(wǎng)膜發(fā)育以及免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育都必須有細(xì)胞死亡的參與。這些形形色色的在機(jī)體發(fā)育過程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡有一個(gè)共同特征:即散在的、逐個(gè)地從正常組織中死亡和消失,機(jī)體無炎癥反應(yīng)，而且對整個(gè)機(jī)體的發(fā)育是有利和必須的。因此認(rèn)為動(dòng)物發(fā)育過程中存在的細(xì)胞程序性死亡是一個(gè)發(fā)育學(xué)概念，而細(xì)胞凋亡則是一個(gè)形態(tài)學(xué)的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學(xué)特征的與壞死完全不同的細(xì)胞死亡形式。但是一般認(rèn)為凋亡和程序性死亡兩個(gè)概念可以交互使用，具有同等意義。2．細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別：雖然凋亡與壞死的最終結(jié)果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。壞死(necrosis):壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。凋亡是細(xì)胞對環(huán)境的生理性病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征1．形態(tài)學(xué)變化形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡的變化是多階段的，細(xì)胞凋亡往往涉及單個(gè)細(xì)胞，即便是一小部分細(xì)胞也是非同步發(fā)生的。首先出現(xiàn)的是細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體，無內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。2．生物化學(xué)變化DNA的片段化細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著特點(diǎn)是細(xì)胞染色體的DNA降解，這是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的DNA片段約為180-200bp的整倍數(shù)，而這正好是纏繞組蛋白寡聚體的長度，提示染色體DNA恰好是在核小體與核小體的連接部位被切斷，產(chǎn)生不同長度的寡聚核小體片段，實(shí)驗(yàn)證明，這種DNA的有控降解是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用的結(jié)果，該酶在核小體連接部位切斷染色體DNA,這種降解表現(xiàn)在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖譜。大分子合成細(xì)胞凋亡的生化改變不僅僅是DNA的有控降解,在細(xì)胞凋亡的過程中往往還有新的基因的表達(dá)和某些生物大分子的合成作為調(diào)控因子。如我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的TFAR-19就是在細(xì)胞凋亡時(shí)高表達(dá)一種分子，再如在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)鼠胸腺細(xì)胞凋亡過程中，加入RNA合成抑制劑或蛋白質(zhì)合成抑制劑即能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡的過程及機(jī)理細(xì)胞凋亡的過程大致可分為以下幾個(gè)階段:接受凋亡信號一凋亡調(diào)控分子間的相互作用一蛋白水解酶的活化(Caspase)—進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程1．凋亡的啟動(dòng)階段細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號刺激后胞內(nèi)一系列控制開關(guān)的開啟或關(guān)閉，不同的外界因素啟動(dòng)凋亡的方式不同，所引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同，客觀上說對細(xì)胞凋亡過程中信號傳遞系統(tǒng)的認(rèn)識還是不全面的，目前比較清楚的通路主要有：1）細(xì)胞凋亡的膜受體通路：各種外界因素是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)劑，它們可以通過不同的信號傳遞系統(tǒng)傳遞凋亡信號，引起細(xì)胞凋亡，我們以Fas-FasL為例：Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，它與FasL結(jié)合可以啟動(dòng)凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡。它的活化包括一系列步驟：首先配體誘導(dǎo)受體三聚體化，然后在細(xì)胞膜上形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物中包括帶有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白FADD。Fas又稱CD95，是由325個(gè)氨基酸組成的受體分子，F(xiàn)as—旦和配體FasL結(jié)合，可通過Fas分子啟動(dòng)致死性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起細(xì)胞一系列特征性變化，使細(xì)胞死亡。Fas作為一種普遍表達(dá)的受體分子，可出現(xiàn)于多種細(xì)胞表面，但FasL的表達(dá)卻有其特點(diǎn)，通常只出現(xiàn)于活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞，因而已被活化的殺傷性免疫細(xì)胞，往往能夠最有效地以凋亡途徑置靶細(xì)胞于死地。Fas分子胞內(nèi)段帶有特殊的死亡結(jié)構(gòu)域（DD,deathdomain）。三聚化的Fas和FasL結(jié)合后，使三個(gè)Fas分子的死亡結(jié)構(gòu)域相聚成簇，吸引了胞漿中另一種帶有相同死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白FADD。FADD是死亡信號轉(zhuǎn)錄中的一個(gè)連接蛋白，它由兩部分組成：C端（DD結(jié)構(gòu)域）和N端（DED）部分。DD結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)和Fas分子胞內(nèi)段上的DD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，該蛋白再以DED連接另一個(gè)帶有DED的后續(xù)成分，由此引起N段DED隨即與無活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原發(fā)生同嗜性交聯(lián)，聚合多個(gè)caspase8的分子，caspase8分子逐由單鏈酶原轉(zhuǎn)成有活性的雙鏈蛋白，進(jìn)而引起隨后的級聯(lián)反應(yīng)，即Caspases，后者作為酶原而被激活，引起下面的級聯(lián)反應(yīng)。細(xì)胞發(fā)生凋亡。因而TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑與此類似2）細(xì)胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學(xué)途經(jīng)線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心。實(shí)驗(yàn)表明了細(xì)胞色素C從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。釋放到細(xì)胞漿的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1（Apaf-1）結(jié)合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，線粒體還釋放凋亡誘導(dǎo)因子，如AIF，參與激活caspase。可見，細(xì)胞凋亡小體的相關(guān)組份存在于正常細(xì)胞的不同部位。促凋亡因子能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放和凋亡小體的形成。很顯然，細(xì)胞色素C從線粒體釋放的調(diào)節(jié)是細(xì)胞凋亡分子機(jī)理研究的關(guān)鍵問題。多數(shù)凋亡刺激因子通過線粒體激活細(xì)胞凋亡途經(jīng)。有人認(rèn)為受體介導(dǎo)的凋亡途經(jīng)也有細(xì)胞色素C從線粒體的釋放。如對Fas應(yīng)答的細(xì)胞中，一類細(xì)胞（type1）中含有足夠的胱解酶8（caspase8）可被死亡受體活化從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在這類細(xì)胞中高表達(dá)Bcl-2并不能抑制Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在另一類細(xì)胞（type2）如肝細(xì)胞中，F(xiàn)as受體介導(dǎo)的胱解酶8活化不能達(dá)到很高的水平。因此這類細(xì)胞中的凋亡信號需要借助凋亡的線粒體途經(jīng)來放大，而Bid--一種僅含有BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族蛋白是將凋亡信號從胱解酶8向線粒體傳遞的信使。2．凋亡的執(zhí)行盡管凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，但是已經(jīng)確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細(xì)胞凋亡的過程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)過程，到目前為止，至少已有14種Caspase被發(fā)現(xiàn)，Caspase分子間的同源性很高，結(jié)構(gòu)相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根據(jù)功能可把Caspase基本分為二類：一類參與細(xì)胞的加工，如Pro-IL-1B和Pro-IL-16，形成有活性的IL-1R和IL-16；第二類參與細(xì)胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：1） C端同源區(qū)存在半胱氨酸激活位點(diǎn)，此激活位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域?yàn)镼ACR/QG。2） 通常以酶原的形式存在，相對分子質(zhì)量29000-49000（29-49KD），在受到激活后其內(nèi)部保守的天冬氨酸殘基經(jīng)水解形成大（P20）?。≒10）兩個(gè)亞單位，并進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體，其中，每個(gè)P20/P10異二聚體可來源于同一前體分子也可來源于兩個(gè)不同的前體分子。未端具有一個(gè)小的或大的原結(jié)構(gòu)域。參與誘導(dǎo)凋亡的Caspase分成兩大類：啟動(dòng)酶(inititaor)和效應(yīng)酶(effector)它們分別在死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游和下游發(fā)揮作用。Caspase活化機(jī)制：Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，Caspase分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個(gè)二聚體形成有活性的四聚體。去除N-端前肽是Caspase的活化的第一步，也是必須的，但是Caspase-9的活化不需要去除N-端前肽，Caspase活化基本有兩種機(jī)制，即同源活化和異源活化，這兩種活化方式密切相關(guān)，一般來說后者是前者的結(jié)果，發(fā)生同源活化的Caspase又被稱為啟動(dòng)caspase(initiatorcaspase)，包括caspase-8,T0,-9，誘導(dǎo)凋亡后，起女臺Caspase通過adaptor被募集到特定的起始活化復(fù)合體，形成同源二聚體構(gòu)像改變，導(dǎo)致同源分子之間的酶切而自身活化，通常caspase-8,10,2介導(dǎo)死亡受體通路的細(xì)胞凋亡，分別被募集到Fas和TNFR1死亡受體復(fù)合物，而Caspase-9參與線粒體通路的細(xì)胞凋亡，則被募集到Cytc/dATP/Apaf-1組成的凋亡體(apoptosome)。同源活化是細(xì)胞凋亡過程中最早發(fā)生的capases水解活化事件，啟動(dòng)Caspase活化后，即開啟細(xì)胞內(nèi)的死亡程序，通過異源活化方式水解下游Caspase將凋亡信號放大，同時(shí)將死亡信號向下傳遞。異源活化(hetero-activation)即由一種caspase活化另一種caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經(jīng)典途徑。被異源活化的Caspase又稱為執(zhí)行caspase(executionercaspase)，包括Caspase-3,-6,-7。執(zhí)行Caspase不象啟動(dòng)Caspase，不能被募集到或結(jié)合起臺活化復(fù)合體，它們必須依賴啟動(dòng)Caspase才能活化。Caspase的效應(yīng)機(jī)制凋亡細(xì)胞的特征性表現(xiàn)，包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜活化，細(xì)胞皺縮，最后形成由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體，然后，這些凋亡小體被其他細(xì)胞所吞噬，這一過程大約經(jīng)歷30-60分鐘，Caspase引起上述細(xì)胞凋亡相關(guān)變化的全過程尚不完全清楚，但至少包括以下三種機(jī)制：1．凋亡抑制物正常活細(xì)胞因?yàn)楹怂崦柑幱跓o活性狀態(tài)，而不出現(xiàn)DNA斷裂，這是由于核酸酶和抑制物結(jié)合在一起，如果抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化(fragmentation)。現(xiàn)知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶(caspase-activateddeoxyribonuleaseCAD)，而把它的抑制物稱為ICAD。因而，在正常情況下，CAD不顯示活性是因?yàn)镃AD-ICAD，以一種無活性的復(fù)合物形式存在。ICAD—旦被Caspase水解，即賦予CAD以核酸酶活性，DNA片段化即產(chǎn)生，有意義的是CAD只在ICAD存在時(shí)才能合成并顯示活性，提示CAD-ICAD以一種其轉(zhuǎn)錄方式存在，因而ICAD對CAD的活化與抑制卻是必需要的。2．破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如裂解核纖層，核纖層(Lamina)是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)(chromatin)得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個(gè)近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。3．調(diào)節(jié)蛋白喪失功能Caspase可作用于幾種與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的酶或蛋白，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)。其中包括凝膠原蛋白(gelsin)、聚合粘附激酶(focaladhesionkinase,FAK)、P21活化激酶a(PAKa)等。這些蛋白的裂解導(dǎo)致其活性下降。如Caspase可裂解凝膠原蛋白而產(chǎn)生片段，使之不能通過肌動(dòng)蛋白(actin)纖維來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架。除此之外，Caspase還能滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細(xì)胞的增殖與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡。所有這些都表明Caspase以一種有條不紊的方式進(jìn)行〃破壞〃，它們切斷細(xì)胞與周圍的聯(lián)系，拆散細(xì)胞骨架，阻斷細(xì)胞DNA復(fù)制和修復(fù)，干擾mRNA剪切，損傷DNA與核結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)可被其他的細(xì)胞吞噬的信號，并進(jìn)一步使之降解為凋亡小體。細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控，在正常細(xì)胞Caspase處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，Caspase被活經(jīng)隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生不可逆的凋亡。細(xì)胞是如何準(zhǔn)確而又精確調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡呢？舉例如下：1．凋亡抑制分子：迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制分子，包括P35,CrmA,IAPs,FLIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。P35和CrmA是廣譜凋亡抑制劑，體外研究結(jié)果表明P35以競爭性結(jié)合方式與靶分子形成穩(wěn)定的具有空間位阻效應(yīng)的復(fù)合體并且抑制Caspases活性，同時(shí)P35在位點(diǎn)DMQD！G被靶Caspases特異切割，切割后的P35與caspase的結(jié)合更強(qiáng)，CrmA(CytokineresponsemodferA)是血清蛋白酶抑制劑，能夠直接抑制多種蛋白酶的活性，但目前還未發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)P35和CrmA的同源分子。FLIPs(FLICE-imhibiroryproterins)能抑制Fas/TNFRl介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。它有多種變異體，但其N-端功能前區(qū)(Prodomain)完全相同，C端長短不一。FLIPs通過DED功能區(qū)，與FADD和Caspase-8，10結(jié)合，拮抗它們之間的相互作用，從而抑制Caspase8，10募集到死亡受體復(fù)合體和它們的起始化。凋亡抑制蛋白(IAPs,inhibitorsofApoptosisprotien)為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質(zhì)，首先是從桿狀病毒基因組克隆到，發(fā)現(xiàn)能夠抑制由病毒感染引起的宿主細(xì)胞死亡應(yīng)答。其特性是有大約20氨基酸組成的功能區(qū)，這對IAPs抑制凋亡是必需要的，它們主要抑制Caspase3,-7，而不結(jié)合它的酶原，對Caspase則即可以結(jié)合活化的，又可結(jié)合酶原，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。2．Bcl-2家族：這一家族有眾多成員，如Mcl-1、NR-B、A1、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等，它們分別既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。多數(shù)成員間有兩個(gè)結(jié)構(gòu)同源區(qū)域，在介導(dǎo)成員之間的二聚體化過程中起重要作用。Bcl-2成員之間的二聚體化是成員之間功能實(shí)現(xiàn)或功能調(diào)節(jié)的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命，在一些白血病中Bcl-2呈過度表達(dá)。Bcl-2的亞細(xì)胞定位已經(jīng)明確，它在不同的細(xì)胞類型可以定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核膜上，并通過阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。此外，Bcl-2具有保護(hù)細(xì)胞的功能，Bcl-2的過度表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱苷肽(GSH)的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中參與細(xì)胞凋亡的一個(gè)成員，當(dāng)誘導(dǎo)凋亡時(shí)，它從胞液遷移到線粒體和核膜。有人研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞毒性藥物誘發(fā)凋亡時(shí)，核膜Bax水平的上升與lamin及PARP兩種核蛋白的降解呈正相關(guān)。用Bax寡核苷酸處理的細(xì)胞，只能特異地阻斷Lamin的降解，對PARP的降解不起作用。這種效應(yīng)的調(diào)控機(jī)制目前仍然不清楚?？傊?，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的，參與的分子也非常多，還有很多不為我們所知的機(jī)理需要我們一步的探索。細(xì)胞凋亡與醫(yī)學(xué)1．免疫學(xué)：1）胸腺細(xì)胞成熟過程中的凋亡：胸腺細(xì)胞經(jīng)過一系列的發(fā)育過程而成為各種類型的免疫活性細(xì)胞。在這一發(fā)展過程中，涉及了一系列的陽性細(xì)胞選擇和陰性細(xì)胞選擇過程。以形成CD4+的T淋巴細(xì)胞亞型及CD8+的T淋巴細(xì)胞亞型；同時(shí)，對識別自身抗原的T細(xì)胞克隆進(jìn)行選擇性地消除，其細(xì)胞克隆死亡的機(jī)制主要是通過程序性細(xì)胞死亡。因此，正常的免疫系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)局，既形成了有免疫活性的淋巴細(xì)胞，又產(chǎn)生了對自身抗原的免疫耐受。耐受機(jī)制的形成，主要靠識別自身抗原的T淋巴細(xì)胞克隆的程序性細(xì)胞死亡機(jī)制的活化。2）活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡：（activation-inducedcelldeath,AICD）是T淋巴細(xì)胞程序性死亡的又一個(gè)主要類型。正常的T淋巴細(xì)胞在受到入侵的抗原刺激后，T淋巴細(xì)胞被激活，并誘導(dǎo)出一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)。機(jī)體為了防止過高的免疫應(yīng)答,或防止這種免疫應(yīng)答無限制地發(fā)展下去，便有AICD來控制激活T細(xì)胞的壽命。實(shí)際上：T淋巴細(xì)胞的增殖與T淋巴細(xì)胞AICD具有共同的信號通路。T淋巴細(xì)胞受到刺激后就開始活化，活化以后的T淋巴細(xì)胞如果有生長因子的存在，即發(fā)生生殖反應(yīng)，如果沒有或較少的生長因子的存在，則發(fā)生AICD。3）淋巴細(xì)胞對靶細(xì)胞的攻擊：免疫活性細(xì)胞，特別是淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK），是過繼性免疫治療的一種重要形式。在抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。這些免疫活性細(xì)胞在攻擊腫瘤細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞時(shí)，可誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。2．臨床醫(yī)學(xué)：細(xì)胞凋亡之所以成為人們研究的一個(gè)熱點(diǎn)，在很大程度上決定于細(xì)胞凋亡與臨床病毒的密切關(guān)系。這種關(guān)系不僅表現(xiàn)在凋亡及其機(jī)制的研究，闡明了一大類免疫病的發(fā)病機(jī)制，而且由此可以導(dǎo)致疾病新療法的出現(xiàn)，特別是細(xì)胞凋亡與腫瘤及愛滋病之間的密切關(guān)系倍受人們重視。1） HIV病毒感染造成CD4+細(xì)胞減少是通過細(xì)胞凋亡機(jī)制HIV感染引起愛滋病，其主要的發(fā)病機(jī)制是HIV感染后特異性地破壞CD4+細(xì)胞，使CD4+以及與其相關(guān)的免疫功能缺陷，易招致機(jī)會性感染及腫瘤，但HIV感染后怎樣特異性破壞CD4+細(xì)胞呢？近年認(rèn)為，CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)顯著減少的原因，主要是通過細(xì)胞凋亡機(jī)制造成的。這不僅闡明了AIDS時(shí)CD4+T細(xì)胞減少的主要原因，同時(shí)也為AIDS的治療研究指明了一個(gè)重要的探索方向。2） 從細(xì)胞凋亡角度看，腫瘤的發(fā)生是由于凋亡受阻所致一般認(rèn)為惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞是因?yàn)槭Э厣L，過度增殖，從細(xì)胞凋亡的角度看則認(rèn)為是腫瘤的凋亡機(jī)制受到抑制不能正常進(jìn)行細(xì)胞死亡清除的結(jié)果。腫瘤細(xì)胞中有一系列的癌基因和原癌基因被激活，并呈過表達(dá)狀態(tài)。這些基因的激活和腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間有著及為密切的關(guān)系。癌基因中一大類屬于生長因子家族，也有一大類屬于生長因子受體家族，這些基因的激活與表達(dá)，直接刺激了腫瘤細(xì)胞的生長，這些癌基因及其表達(dá)產(chǎn)物也是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子許多種類的癌基因表達(dá)以后，即阻斷了腫瘤細(xì)胞的凋亡過程，使腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加，因此，從細(xì)胞凋亡角度來理解腫瘤的發(fā)生機(jī)制，是由于腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制，腫瘤細(xì)胞減少受阻所致。因此，通過細(xì)胞凋亡角度和機(jī)制來設(shè)計(jì)對腫瘤的治療方法就是重建腫瘤細(xì)胞的凋亡信號轉(zhuǎn)遞系統(tǒng)，即抑制腫瘤細(xì)胞的生存基因的表達(dá)，激活死亡基因的表達(dá)。3） 細(xì)胞凋亡的研究將給自身免疫病帶來真正的突破自身免疫病包括一大類難治性的免疫紊亂而造成的疾病，自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞及產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞是引起自身免疫病的主要免疫病理機(jī)制，正常情況下，免疫細(xì)胞的活化是一個(gè)極為復(fù)雜的過程。在自身抗原的刺激作用下，識別自身抗原的免疫細(xì)胞被活化，從而通過細(xì)胞凋亡的機(jī)制而得到清除。但如這一機(jī)制發(fā)生障礙，那么識別自身抗原的免疫活性細(xì)胞的清除就會產(chǎn)生障礙。有人觀察到在淋巴增生突變小鼠中觀察到Fas編碼的基因異常，不能翻譯正常的Fas跨膜蛋白分子，如Fas異常，由其介導(dǎo)的凋亡機(jī)制也同時(shí)受阻，便造成淋巴細(xì)胞增殖性的自身免疫疾患。4） 神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變：目前知道老年性癡呆是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的加速而產(chǎn)生的。阿爾茨海默?。ˋD）是一種不可逆的退行性神經(jīng)疾病，淀粉樣前體蛋白（APP）早老蛋白-1（PS1）早老蛋白-2（PS2）的突變導(dǎo)致家族性阿爾茨海默?。‵AD）。研究證明PS參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控PS1、PS2的過表達(dá)能增強(qiáng)細(xì)胞對凋亡信號的敏感性oBcl-2基因家族兩個(gè)成員Bcl-xl和Bcl-2參與對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。線粒體與細(xì)胞凋亡線粒體是真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器，是動(dòng)物細(xì)胞生成ATP的主要地點(diǎn)。線粒體基質(zhì)的三羧酸循環(huán)酶系通過底物脫氫氧化生成NADHoNADH通過線粒體內(nèi)膜呼吸鏈氧化。與此同時(shí)，導(dǎo)致跨膜質(zhì)子移位形成跨膜質(zhì)子梯度和/或跨膜電位。線粒體內(nèi)膜上的ATP合成酶利用跨膜質(zhì)子梯度能量合成ATPo合成的ATP通過線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體與細(xì)胞質(zhì)中ADP交換進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞的各種需能過程。1951年Glucksmann提出正常脊椎動(dòng)物發(fā)育中的細(xì)胞死亡。1966年Saunders提出在形態(tài)發(fā)生中細(xì)胞死亡°1972年Kerr提出細(xì)胞凋亡（apoptosis），說明這是在組織動(dòng)力學(xué)方面有廣泛作用的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象。1974年Lockshin提出細(xì)胞程序性死亡。美國麻省理工學(xué)院Horvitz在研究線蟲發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)線蟲的每個(gè)細(xì)胞的位置、分裂與命運(yùn)都是由遺傳決定的程序所精確地預(yù)先確定的。在構(gòu)成成蟲體時(shí)有1090個(gè)細(xì)胞誕生，131個(gè)細(xì)胞死亡。1993年袁鈞瑛發(fā)現(xiàn)線蟲的死亡基因ced-3的產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳類白細(xì)胞介素10轉(zhuǎn)換酶有同源性。此后，屬于同一家族的十幾個(gè)相關(guān)基因陸續(xù)在哺乳動(dòng)物基因組中被發(fā)現(xiàn)。統(tǒng)稱為胱冬肽酶（caspases）。1994年Hengartner發(fā)現(xiàn)線蟲的存活基因ced-9的產(chǎn)物與哺乳動(dòng)物原癌基因bcl-2的產(chǎn)物相似。細(xì)胞凋亡的特征是細(xì)胞由于降解酶，主要是水解酶（蛋白酶與核酸酶）的作用，在近乎正常的細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)趨向死亡。這與壞死時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜早期破損不同。在細(xì)胞凋亡過程中，質(zhì)膜脂雙層喪失二側(cè)不對稱性，磷脂酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面，從而導(dǎo)致被吞噬。線粒體跨膜電位的耗散與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系近年來陸續(xù)有報(bào)道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細(xì)胞就會進(jìn)入不可逆的凋亡過程。線粒體解聯(lián)的呼吸鏈會產(chǎn)生大量活性氧，氧化線粒體內(nèi)膜上的心磷脂。實(shí)驗(yàn)證明，用解偶聯(lián)劑mClCCP會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡。而如果能穩(wěn)定線粒體跨膜電位就能防止細(xì)胞凋亡。線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道在細(xì)胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內(nèi)膜的通透性轉(zhuǎn)變，這是由于生成了動(dòng)態(tài)的由多個(gè)蛋白質(zhì)組成的位于線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點(diǎn)的通透性轉(zhuǎn)變孔道（PT孔道）（圖1）。PT孔道由線粒體各部分的蛋白質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)聯(lián)合構(gòu)成。這包括細(xì)胞液蛋白：己糖激酶，線粒體外膜蛋白：外周苯并二嗪（benzodiazepine）受體與電壓依賴陰離子通道，線粒體膜間間隙蛋白：肌酸激酶，線粒體內(nèi)膜蛋白：ADP-ATP載體，線粒體基質(zhì)蛋白：親環(huán)蛋白D（cyclophilinD）等。凡是能夠?qū)Ｒ蛔饔糜诰€粒體誘導(dǎo)PT孔道生成的物質(zhì)，例如苯并二嗪受體的配基原卟啉IX等都能引起細(xì)胞凋亡。PT孔道的性質(zhì)通過一些實(shí)驗(yàn)室的研究，以下諸點(diǎn)值得指出：（1）線粒體內(nèi)膜通透性轉(zhuǎn)變既是細(xì)胞凋亡的必須條件，也是它的充足條件。（2）PT孔道打開后導(dǎo)致線粒體許多功能的致命性變化從而啟動(dòng)了死亡途徑。（3）PT孔道作為許多生理效應(yīng)的感受器（二價(jià)陽離子、ATP、ADP、NAD、△屮m、pH、巰基與多肽)，整合了電生理、氧化還原與細(xì)胞代謝狀態(tài)的信息。(4)PT孔道的組成成分ADP-ATP載體是能量代謝的重要分子，由于ADP-ATP載體是由一個(gè)基因家族的幾個(gè)成員所編碼，它的表達(dá)有嚴(yán)格的組織專一性。因此，PT孔道在不同細(xì)胞中的調(diào)節(jié)可能稍有不同。(5)PT孔道的作用有自放大的效應(yīng)。PT誘導(dǎo)△屮m耗散，而反過來mClCCP使△屮m去極化會導(dǎo)致PT。一些PT的結(jié)果例如△屮m耗散，活性氧的生成本身也會導(dǎo)致PT。這就說明PT會有正反饋，從而在細(xì)胞凋亡中有自摧毀的作用。反過來，如果能防止△屮m的耗散，就能避免氧化還原不平衡、磷酯酰絲氨酸的暴露與蛋白酶和核酸酶的激活。PT孔道的開放與關(guān)閉PT孔道有開放與關(guān)閉二種構(gòu)象。PT孔道開放導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而PT孔道關(guān)閉能防止細(xì)胞凋亡。當(dāng)PT孔道與環(huán)抱菌素A(cyclosporinA)或SH,或米酵菌酸(bongkrekacid)結(jié)合時(shí)PT孔道被關(guān)閉。在PT孔道開放時(shí)線粒體釋放細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)。AIF可能是一種蛋白水解酶，位于線粒體膜間間隙，它能被蛋白酶抑制劑如N-芐氧羰基-纈氨酰-丙氨酰-門冬氨酰氟甲基酮(N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone)所抑制。此外從線粒體釋放的細(xì)胞色素C也是一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子。雖然蒼術(shù)苷與米酵菌酸都是ADP-ATP載體的抑制劑，但是它們對PT孔道的作用并不相同。蒼術(shù)苷促進(jìn)PT通道開放。這可能與二種抑制劑和ADP-ATP載體的結(jié)合部位不同有關(guān)。蒼術(shù)苷只能與ADP-ATP載體的胞液側(cè)結(jié)合而米酵菌酸可與ADP-ATP載體的胞液及基質(zhì)二側(cè)結(jié)線粒體在細(xì)胞凋亡作用中的進(jìn)一步證據(jù)(1)若將純化的正常的線粒體與純化的細(xì)胞核在一起保溫，并不導(dǎo)致細(xì)胞核的變化。但若將誘導(dǎo)生成PT孔道的線粒體與純化的細(xì)胞核一同保溫，細(xì)胞核即開始凋亡變化。(2)細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白不論是抑制死亡的bcl-2家族還是促進(jìn)細(xì)胞死亡的Bax家族均以線粒體作為靶細(xì)胞器。bcl-2蛋白的C端的疏水肽段能插入線粒體外膜。事實(shí)上相當(dāng)量的bcl-2位于線粒體內(nèi)外膜的接觸位點(diǎn)。(3)高表達(dá)bcl-2能防止△屮m的耗散，從而導(dǎo)致對蒼術(shù)苷、原卟啉IX與mClCCP的不敏感與AIF釋放的抑制；反之，高表達(dá)Bax則導(dǎo)致△屮m的耗散。綜上所述，細(xì)胞凋亡與線粒體的結(jié)構(gòu)與功能有著密切的關(guān)系。如果線粒體有大量PT孔道形成，細(xì)胞ATP濃度很快下降，則在致凋亡的蛋白酶被活化前細(xì)胞就壞死了。而如果PT孔道的誘導(dǎo)生成是一種比較緩和與持續(xù)的狀態(tài)，在細(xì)胞ATP濃度下降前專一的蛋白酶被激活；而另一方面△屮m的耗散產(chǎn)生的超氧陰離子則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡是一把雙刃劍。一方面是機(jī)體發(fā)育的正常過程，另一方面如果細(xì)胞凋亡過速，則會導(dǎo)致慢性退行性病變；如果細(xì)胞不凋亡就有可能導(dǎo)致癌變或?qū)煹牟幻舾?。進(jìn)一步研究線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用，有助于深入了解細(xì)胞凋亡的機(jī)制與對疾病的防治。細(xì)胞凋亡的檢測1．早期檢測:1） PS（磷脂酰絲氨酸）在細(xì)胞外膜上的檢測：PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生,可能作為免疫系統(tǒng)的識別標(biāo)志。AnnexinV,—個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS,再通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測（懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結(jié)合來標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。美國著名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發(fā)了多種標(biāo)記的AnnexinV產(chǎn)品，簡便快速，10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標(biāo)記的AnnexinV-EGFP（EnhancedGreenFluorescentProtein）及AnnexinV-FITC，靈敏度高，可作為FACS（流式細(xì)胞分選）方法篩選凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ)。由于融合蛋白AnnexinV-EGFP，EGFP與PS的結(jié)合比例為1：1，還可進(jìn)行定量檢測。除此之外，還提供生物素偶聯(lián)的AnnexinV，可通過常用的酶聯(lián)顯色反應(yīng)來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被AnnexinV，可采用磁分選方法篩選凋亡細(xì)胞。2）細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：這反應(yīng)了細(xì)胞凋亡研究中相對較新的趨勢，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetectionKit通過熒光染料monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。正常狀態(tài)下,谷光苷肽（glutathione：GSH）作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細(xì)胞中，細(xì)胞膜中有可被凋亡信號啟動(dòng)的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非?；钴S時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反應(yīng)。由于GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān)，此項(xiàng)檢測除了對研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如：HeLa和3T3細(xì)胞凋亡時(shí)沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。3）細(xì)胞色素C的定位檢測細(xì)胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液，結(jié)合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后啟動(dòng)caspase級聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細(xì)胞色素C氧化酶亞單位IV（cytochromecoxidasesubunitW：C0X4）是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時(shí)，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志。ApoAlertTMCellFractionationKit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細(xì)胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進(jìn)一步通過Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。4） 線粒體膜電位變化的檢測：在凋亡研究的早期，從形態(tài)學(xué)觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM,—個(gè)陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlertMitochondrialMembraneSensorKit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是，