中華老琥草根莖及根酸鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

中華老琥草根莖及根酸鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

中國(guó)古鸛草是一個(gè)非典型的古鸛草，主要產(chǎn)于四川省阿壩地區(qū)。本項(xiàng)研究中選用藥用部分是該植物的地下根莖及根,其地下根莖及根經(jīng)提取的有效部位,是一類多元酚化合物(鞣質(zhì))。經(jīng)毒理及藥效學(xué)研究結(jié)果表明,此類化合物具有明顯的抗炎、止痛、止血、抗突變等功效,且具低毒、安全的特點(diǎn),有較高價(jià)值的新藥開(kāi)發(fā)前景。本實(shí)驗(yàn)為控制其有效部位及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),采用TLC圖譜進(jìn)行有效部位(鞣質(zhì))的鑒別;分別采用皮粉法(中國(guó)藥典2000版一部,附錄XB鞣質(zhì)含量測(cè)定法)及比色法(酒石酸亞鐵為顯色劑)測(cè)定有效部位(鞣質(zhì))的含量。為中華老鸛草根莖及根提取物的質(zhì)量控制建立定性及定量的標(biāo)準(zhǔn)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器、材料和測(cè)試材料1.1.1儀器薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司);722型分光光度計(jì)(上海分析儀器三廠)。1.1.2純?cè)囁幍姆此紱](méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所),鞣酸,酒石酸鉀鈉,硫酸亞鐵,磷酸氫二鈉,氫氧化鈉,皮粉等分析純?cè)囁?AB_8型大孔吸附樹(shù)脂(南開(kāi)大學(xué)化工廠),聚酰胺薄膜(8cm×8cm)[浙江臺(tái)州四甲生化塑料廠]。1.1.3中華老鰲草粉的制備在四川省阿壩地區(qū)采集,經(jīng)中國(guó)科學(xué)院成都生物所高寶莼研究員鑒定為中華老鸛草,取地下根莖及根部分,除雜泥,切片,曬干,粉碎,過(guò)3#篩,得棕黃色粉末。1.1.4ab-8大孔吸附樹(shù)脂柱的制備稱取鞣酸(分析純含鞣酸87%)20g,加水50ml溶解后,加95%乙醇150ml,充分?jǐn)嚢?0min,置于冰箱(2℃～8℃)放置過(guò)夜,次日,離心(4000rpm),濾過(guò),濾液經(jīng)減壓加熱,回收乙醇,濃縮,干燥(-0.085MPa.30℃～70℃)得約18g黃色粉末。加水約500ml溶解,濾過(guò),濾液通過(guò)已處理的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱(?30mm.H150mm～200mm),以吸附流速20ml.min-1。待濾液全部過(guò)柱后,以水淋洗樹(shù)脂柱(水約1500ml)。淋洗流速20～30ml.min-1,水淋洗后,再以60%乙醇脫洗樹(shù)脂柱,脫洗流速20ml.min-1,收集乙醇洗脫液(約500ml),減壓加熱,回收乙醇,濃縮,干燥(-0.085MPa,30℃～70°C)得黃色粉末約13.5g(含鞣酸98.07%,沒(méi)食子酸<0.2%)。1.1.5酒石酸亞鐵試劑稱取硫酸亞鐵1g與酒石酸鉀鈉5g,以水溶解,濾過(guò),添加水至100ml,即得。1.1.6磷酸緩沖液ph7.4稱取磷酸二氫鉀1.36g,加氫氧化鈉液(0.1mol.L-1)79ml,用水稀釋至200ml,即得。1.2對(duì)照品溶液的制備取中華老鸛草根莖及根提取物樣品0.5g,加甲醇5ml,超聲處理15min,濾過(guò),濾液作為供試品溶液;另取中華老鸛草根莖藥材粉末1g,加甲醇5ml,超聲處理15min,濾過(guò),濾液作為對(duì)照藥材溶液;稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品5mg,加甲醇5ml,超聲處理15min,濾過(guò),濾液作為對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各5μl,分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜片上(8cm×8cm),以氯仿—甲酸乙酯—甲酸(5:5:1)為展開(kāi)劑,展開(kāi)(展距7cm),取出,晾干,噴以1%三氯化鋁乙醇液,晾干,置于紫外燈(365nm)下檢視,供試品色譜與對(duì)照藥材,沒(méi)食子酸對(duì)照品相應(yīng)位置上,顯相同的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖。1.3重量測(cè)定1.3.1酸對(duì)照液的制備精密稱取鞣酸精制品(105℃干燥恒重)0.4124g,置入250ml量瓶中,以水溶解并定容,搖勻,濾過(guò),即得1.618mg.ml-1的鞣酸對(duì)照液。1.3.2白色溶液的制備吸取水5ml,酒石酸亞鐵試液5ml及磷酸鹽緩沖液(pH7.4),混勻后,濾過(guò),即得。1.3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的確定以測(cè)試的鞣酸溶液(1.618mg.ml-1),按擬定的測(cè)定方法(1.3.4),在不同波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,540nm處有最大吸收值,選擇540nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。1.3.4吸收劑濃度試驗(yàn)精密吸取鞣酸對(duì)照液2、5、10、20、25ml,分別置于100ml量瓶中,以水定容,搖勻,過(guò)濾,分別精密吸取濾液5ml,移入25ml量瓶中,添加酒石酸亞鐵試液5ml,并以磷酸鹽緩沖液(pH7.4)定容,搖勻。以空白溶液對(duì)照,用1cm比色杯,在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度(A)。分別以各鞣酸對(duì)照液的吸收度(A)對(duì)鞣酸量(C)進(jìn)行直線回歸,得線性回歸方程:A=0.021C+0.0026,r=0.9999,結(jié)果表明鞣酸量在3.236～40.45mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。1.3.5精密度0.1264精密吸取鞣酸對(duì)照液10ml及精密稱取中華老鸛草(根莖及根)提取物(批號(hào)020914)0.0286g,分別按前(1.3.4)方法,分別連續(xù)5次重復(fù)測(cè)定,其吸收度值的RSD=0.24%,表明該方法精密度良好,結(jié)果見(jiàn)表2。1.3.6吸收度測(cè)定方法見(jiàn)表1精密吸取鞣酸對(duì)照品溶液10ml及精密稱取中華老鸛草根莖提取物(批號(hào)020914)0.0286g,分別按前述(1.3.4)測(cè)定方法制備供試溶液,在添加酒石酸亞鐵試液及緩沖液定容,顯色后,分別在0、15、30、45、60、120min進(jìn)行吸收度測(cè)定,由表3可見(jiàn),供試液溶液顯色后,在15～120min內(nèi)吸收度值穩(wěn)定。1.3.7溶液溶解方式精密稱取中華老鸛草(根莖及根)提取物(批號(hào)020914)共5份,分別置于100ml量瓶中,加水溶解,定容。分別制備5份樣品供試液,按前述(1.3.4)測(cè)定方法進(jìn)行吸收度測(cè)定,由表4可見(jiàn),該方法重現(xiàn)性良好。1.3.8樣品中樣品中酸含量的測(cè)定精密稱取已知鞣酸含量的中華老鸛草根莖及根提取物樣品(批號(hào)020914)約0.03g,共6份,分別置于100ml量瓶中,再分別加入鞣酸對(duì)照品溶液(1.618mg.ml-1)2ml,5ml,10ml,按前(1.3.4)樣品配制及操作,測(cè)定各樣品液的吸收度值,計(jì)算鞣質(zhì)含量。由表5可見(jiàn),該方法回收率在99.1%～100.3%之間,RSD<0.5%,加樣回收率良好。1.3.9比色法與不同含量的中華老鰲草葉片及根提取物中物質(zhì)量的比較按前述(1.3.4)方法測(cè)定3批中試樣品的鞣酸含量。同時(shí)采用中國(guó)藥典(2000年版一部)附錄XB鞣質(zhì)含量測(cè)定法(皮粉法)測(cè)定該3批樣品的鞣酸含量。由表6可見(jiàn),比色法與藥典皮粉法測(cè)定中華老鸛草根莖及根提取物中鞣質(zhì)含量的結(jié)果有一定的相關(guān)性;但比色法RSD<1%,而藥典皮粉法RSD>2%。2tlc-ms-b法測(cè)定出一、三、三含量重的檢測(cè)方法在正行法中,對(duì)于前藥比色法中添加0.2.1中華老鸛草根莖及根提取物中有效部位主要為多元酚化合物(鞣酸),主要相關(guān)物質(zhì)是沒(méi)食子酸,本項(xiàng)研究以中華老鸛草根莖及根藥材及沒(méi)食子酸為對(duì)照品,采用商品制作的聚酰胺薄膜為吸附劑,選以氯仿—甲酸乙酯—甲酸(5:5:1)為展開(kāi)劑,1%三氯化鋁乙醇液為顯色劑,在紫外光燈(365nm)下檢測(cè)。獲得穩(wěn)定,分離效果佳的圖譜,具有特征鑒別效果。2.2本實(shí)驗(yàn)采用以酒石酸亞鐵為顯色劑的比色法用于中華老鸛草(根莖及根)提取物中鞣質(zhì)的含量測(cè)定,替代現(xiàn)版藥典采用的皮粉法。鞣酸為一類多元酚化合物,現(xiàn)無(wú)分離的單一成分的鞣酸對(duì)照品(一般市售分析純鞣酸,鞣酸含量<90%,沒(méi)食子酸含量2%～4%)。本實(shí)驗(yàn)采用醇沉除雜及大孔吸附樹(shù)脂法精制,得相對(duì)純品高的精制品(鞣酸含量≥98%。沒(méi)食子酸含量≤0.2%;同時(shí)具有穩(wěn)定的TLC圖譜及HPLC指紋圖譜),可作為鞣酸對(duì)照品;用于