實(shí)驗(yàn)八九 微生物的生理生化反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)八九微生物的生理生化反應(yīng)一、目的要求

1.了解細(xì)菌的一般生化反應(yīng)；

2.了解細(xì)菌的生化鑒定方法其原理。

二、實(shí)驗(yàn)材料

菌種：大腸桿菌；枯草桿菌；變形桿菌；自己劃線分離的大腸桿菌。

培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基（紫紅色液體）

H2S試驗(yàn)用培養(yǎng)基（固體、試管）

蛋白胨水培養(yǎng)基(吲哚實(shí)驗(yàn)）(液體）

淀粉水解用培養(yǎng)基（固體、平板）

葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（甲基紅實(shí)驗(yàn)）(液體）三、實(shí)驗(yàn)原理及方法

由于各種微生物的新陳代謝類型不同，因此，對各種物質(zhì)利用后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，我們可以用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，這種反應(yīng)稱為生化反應(yīng)。生化反應(yīng)常用來鑒別在形態(tài)或其它方面不易區(qū)別的微生物，例如：腸道細(xì)菌中，大腸桿菌和傷寒桿菌，二者在形態(tài)上不易區(qū)分，但前者能發(fā)酵乳糖，后者不能。因此可以從它們能否發(fā)酵乳糖來區(qū)別它們，所以微生物的生化反應(yīng)是微生物分類鑒定的重要依據(jù)之一。微生物的生理生化反應(yīng)原理1、糖發(fā)酵試驗(yàn)（含碳化合物的分解利用）絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為能源及碳源，但是細(xì)菌的分解糖類的能力上有相當(dāng)大的差異。發(fā)酵后產(chǎn)生的有機(jī)酸：乳酸、醋酸、丙酸等（溴甲酚紫變色范圍pH5.2~6.8,pH<5.2黃色，pH>6.8紫色）

發(fā)酵后產(chǎn)生的氣體：甲烷、H2

、CO2等（杜氏小管內(nèi)有氣泡）微生物的生理生化反應(yīng)原理2、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)?zāi)承┚芊纸夂虻挠袡C(jī)物或無機(jī)物產(chǎn)生硫化氫（H2S），H2S遇金屬鹽類，如鉛鹽、鐵鹽等，則形成黑色的硫化鉛或硫化鐵的沉淀物。從而可斷定H2S的產(chǎn)生與否。本實(shí)驗(yàn)采用含有檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，看是否有黑色沉淀。微生物的生理生化反應(yīng)原理3、甲基紅試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在糖代謝過程中，將培養(yǎng)基中的糖分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基變酸，加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑[pH4.2（紅色）-6.3（黃色）]，可使培養(yǎng)基由原來的桔黃色變?yōu)榧t色，即甲基紅陽性反應(yīng)。微生物的生理生化反應(yīng)原理4、淀粉水解試驗(yàn)（生物大分子的分解利用）微生物對大分子的淀粉不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外淀粉酶將其分解后才能吸收利用。淀粉遇碘液呈藍(lán)色，但在淀粉被細(xì)菌水解的區(qū)域，遇碘不再呈藍(lán)色，這可作為細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶的證據(jù)。結(jié)果：有水解圈—淀粉水解實(shí)驗(yàn)陽性；無水解圈—淀粉水解實(shí)驗(yàn)陰性.用接種環(huán)取少量枯草桿菌在平板的一邊劃“+”字形接種（或點(diǎn)種），另取少量大腸桿菌在平板的另一邊接種，在各培養(yǎng)皿底部標(biāo)明菌名和組別。置37℃溫箱中培養(yǎng)16～20小時(shí)。5．吲哚試驗(yàn)（含氮化化合物的分解利用）

吲哚試驗(yàn)是用來檢測吲哚的產(chǎn)生。有些細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成紅色的玫瑰吲哚。微生物的生理生化反應(yīng)原理四人一組操作配制各類培養(yǎng)基用無菌操作技術(shù)接種37℃培養(yǎng)24h觀察并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)名稱被接菌種1被接菌種2被接菌種3空白對照1.糖發(fā)酵大腸桿菌自備大腸桿菌枯草桿菌不接種2.H2S試驗(yàn)大腸桿菌自備大腸桿菌變形桿菌不接種3.甲基紅試驗(yàn)大腸桿菌自備大腸桿菌枯草桿菌不接種4.淀粉水解實(shí)驗(yàn)大腸桿菌自備大腸桿菌枯草桿菌5.吲哚試驗(yàn)大腸桿菌自備大腸桿菌枯草桿菌不接種接種方案１.糖發(fā)酵試驗(yàn)：經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色者表示為性，同時(shí)觀察小套管中有無氣泡產(chǎn)生。“+”表示產(chǎn)酸；“⊕”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；“-”表示陰性。

2.H2S試驗(yàn)：培養(yǎng)后取出觀察，看有無黑色沉淀產(chǎn)生.有“+”3.吲哚試驗(yàn)：在培養(yǎng)液中先加入乙醚約1毫升（使呈明顯的乙醚層），充分振

蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，這時(shí)再沿

管壁慢慢加入吲哚試劑5~10滴，觀察有無紅色出現(xiàn)。有紅色環(huán)出現(xiàn)者為陽

性，黃色者為陰性。

4、淀粉水解試驗(yàn)：打開皿蓋，滴加少量碘液于培養(yǎng)基上，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使

碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。如果在菌周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉被水解。

透明圈大小說明該菌水解淀粉能力的大小。

5、甲基紅試驗(yàn)（M·R試驗(yàn)）：沿管壁加入甲基紅指示劑3～4滴上層呈紅色者為陽性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)名稱糖發(fā)酵H2S試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)淀粉水解實(shí)驗(yàn)吲