蘋果轉基因研究課件

蘋果轉基因研究

田爽

蘋果轉基因研究

田爽1轉基因蘋果蘋果為世界四大水果之一，是我國的第一大水果，在國民經濟中占有重要地位。但是，由于果樹育種周期長、遺傳背景復雜，傳統(tǒng)的雜交育種方式很難選育出集各種優(yōu)良品質于一身的品種近年來隨著社會的發(fā)展和進步，培育優(yōu)質的蘋果新品種成為民眾的迫切要求。轉基因蘋果2基因工程的發(fā)展為蘋果品種的遺傳改良提供了新的技術方法，縮短育種周期，提高育種效率，為蘋果遺傳育種研究、利用各種遺傳種質資源開辟了一條新的技術途徑轉基因蘋果轉基因蘋果3究竟怎樣定義轉基因蘋果？

轉基因蘋果研究進展如何？

它存在哪些問題？轉基因蘋果究竟怎樣定義轉基因蘋果？

轉基因蘋果研究進展如何？

它存4主要內容定義發(fā)展歷史

研究現狀研究進展存在問題主要內容定義5轉基因技術就是將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術稱之為轉基因技術（Transgenetechnology）1定義轉基因技術就是將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，6“轉基因技術”

（GeneticallyModifiedTechnology）是指使用基因工程或分子生物學技術(不包括傳統(tǒng)育種、細胞及原生質體融合、雜交、誘變、體外受精、體細胞變遷及多倍體誘導等技術)，將遺傳物質導入活細胞或生物體中，產生基因重組現象，并使之表達并遺傳的相關技術“轉基因技術”

（GeneticallyModifie72發(fā)展歷史自1988年首例使用農桿菌轉化成的轉基因果樹－核桃誕生以來，隨后，1989年James等采用農桿菌介導的葉盤共培養(yǎng)法獲得了轉基因綠袖(Greensleeves)蘋果，報告基因新霉素磷酸轉移酶基因和胭脂堿合成酶基因1992年程家勝等在國內報道了獲得轉基因的蘋果試管苗，與James等一樣，用綠袖作為受體植株，農桿菌介導法，不同的是抗卡那霉素的標記基因為氨基葡糖磷酸轉移酶[APH(3)I]基因，報道基因為葡萄糖苷酸酶基因2發(fā)展歷史自82發(fā)展歷史植物轉基因的方法主要有農桿菌介導法、基因槍法、激光法、花粉管通道法等。在植物上轉化成功的例子中，80%是由農桿菌介導轉化的。

2發(fā)展歷史

2發(fā)展歷史2發(fā)展歷史

2發(fā)展歷史2發(fā)展歷史2發(fā)展歷史2發(fā)展歷史93.1蘋果轉基因的受體基因型近年來，在全世界果樹研究者的努力下，轉基因蘋果已取得不小的成就，用于蘋果遺傳轉化研究的受體基因型越來越多，除了綠袖，主要還有

紅元帥、新喬納金、嘎拉、金冠、M26、皇家嘎拉、Elstar、Braeburn、Merlijin、喬納金、富士、王林、金矮生、遼伏、元帥、粉紅佳人以及M7和八楞海棠等3研究現狀3.1蘋果轉基因的受體基因型3研究現狀103研究現狀3.2導入的外源基因目前為止，導入的外源基因有GUS基因、GFP基因、Bt基因、LFY基因、nptⅡ基因、CpTI基因、殺菌肽基因、抗菌肽MB39基因、FT基因、硫堇蛋白Rs-afpl基因、ALS基因(抗除草劑)、rol基因(生長素合成酶基因)、光敏色素B基因、LeIRT、Ferrition等其中抗性基因分別提高了蘋果的抗蟲性、抗病性和抗除草劑的能力；rol基因的導入使蘋果苗在田間表現矮化；光敏色素B基因使蘋果的生長量和干重不同程度減少3研究現狀3.2導入的外源基11

同時，對轉化材料的選擇不再停留在最初的抗性材料篩選上，GUS組織化學檢測及分子水平的檢測(PCR或Southern雜交)技術被普遍采用。由于GUS基因可以在農桿菌中表達，而農桿菌在轉化后的離體培養(yǎng)中至少能存活12個月而不表現生長，所以GUS陽性結果不能準確反映初步轉化頻率

于是，另外一種報道基因——綠色熒光蛋白(GFP)被用于蘋果的遺傳轉化3研究現狀

同時，對轉化材料的選擇不再停留在最初的抗性材料篩選上，12作為熒光標記分子，GFP既具有敏感的標記檢測率，又沒有放射性的危害。GFP檢測方便，熒光穩(wěn)定，易于構建載體且對活細胞無毒害，對目的基因的功能也沒有影響，轉化后細胞可以繼續(xù)傳代。目前，GFP被改造作為轉基因植物的遺傳標記，成為監(jiān)測生物體內基因表達的的十分重要的報告因子另外，許多實驗研究表明甘露糖/PMI篩選體系以pmi為安全標記基因，可以實現對轉化細胞安全、高效的正向選擇。3研究現狀

作為熒光標記分子，GFP既具有敏感的標記檢測率，又沒有放射性13

3.3外源基因導入的方法直接導入法化學物質導入法、電穿孔發(fā)、脂質體法、微注射法、基因槍法（微彈轟擊法）和花粉管通道法等間接導入法土壤農桿菌轉化系統(tǒng)和植物病毒載體系統(tǒng)3研究現狀

3.3外源基因導入的方法3研究現狀143.3外源基因導入的方法在蘋果基因轉化中主要應用電穿孔法、基因槍法和農桿菌介導法。農桿菌介導法以其簡便、高效成為應用最廣泛的轉化方法。3研究現狀

3.3外源基因導入的方法3研究現狀153.4轉基因蘋果的鑒定遺傳轉化的最終目的是獲得能穩(wěn)定表達且遺傳外源目的基因的轉化植株，這就需要不斷觀察和檢測轉基因植株在田間的表現目前使用的轉基因植物的鑒定方法有:分子檢測、免疫技術、利用生理生化指標、標記基因和生物鑒定法3研究現狀

3.4轉基因蘋果的鑒定3研究現狀163研究現狀

3.4轉基因蘋果的鑒定全面檢測需要：1檢測插入外源基因：先做個普通PCR檢測，傳統(tǒng)的要southern雜交檢測插入幾個拷貝，現在可以用Real-Time檢測拷貝數；2表達量檢測：RT-PCR，northern雜交，Real-TimeRT-PCR；3蛋白水平檢測：western雜交4報告基因檢測：Gus，GFP/YFP/RFP等

3研究現狀

3.4轉基因蘋果的鑒定17

4研究進展蘋果轉基因的方法主要有:農桿菌介導法、基因槍法、激光法、花粉管通道法、脂質體法、微注射法、電穿孔法等?，F在，在經常使用的蘋果轉基因技術中，電穿孔法、基因槍法和農桿菌介導法使用的最多。4研究進展蘋果轉基因的方法18

4研究進展4.1農桿菌介導法現在，農桿菌介導法的發(fā)展潮流是提高轉化效率和擴大轉化范圍。常見的影響農桿菌轉化頻率的因素有三大類：侵染力,抗生素,基因型。4研究進展4.1農桿菌介194研究進展侵染力農桿菌的侵染力取決于本身的特性及其受體植株的敏感性。細菌的菌株對轉化頻率的影響很大。最常用的致瘤農桿菌菌株是LBA4404，EHAl05和EHA101，也常用A208SE，A136，C58/Z707最常用的發(fā)根農桿菌菌株則是1855NCPPB和ATCCl5834。4研究進展侵染力204研究進展抗生素抗生素的濃度，種類對轉化都會產生影響。常用的卡那霉素，用量50～100μg/ml，因物種不同而異，卡那霉素的濃度和加入時間須根據外植體和物種的不同進行預先實驗基因型基因型是影響蘋果遺傳轉化率的重要因素，其特異性一般認為與材料的生理狀態(tài)有關，不同株系間進行轉化有差別，且同一屬間差異也往往較大。轉化細胞能否高效再生是基因轉化的主要障礙，受到所用組織的很大影響。4研究進展214研究進展4.2電穿孔法這種方法也被稱為電激法。在使用電穿孔法的研究報告中，大多數的研究報告是轉化原生物質的報告。4.3微彈轟擊法此法也稱基因槍法，最近發(fā)展很快?？捎糜诨驑尫ǖ闹参锝M織、器官相當廣泛，常用的材料是懸浮培養(yǎng)的細胞、營養(yǎng)胚或合子胚、愈傷組織、花粉粒、花軸、葉柄、幼葉、子葉。4研究進展4.2電穿孔法224研究進展4.4花粉管通道法

花粉管通道法是一種較老的植物轉化方法,是我國科學家周光宇在1983年首次在“MethodsinEn-zymology”報道的研究成果4.5吸脹法花粉管途徑法和吸脹法的最大優(yōu)點就是簡單易行，不需要貴重、復雜的設備，無須離體培養(yǎng)就可獲得再生植株。4研究進展4.4花粉管通道法23

5存在問題首先，因為離體材料再生體系的不完善，蘋果轉基因技術盡管發(fā)展的很迅速，但是有些品種由于基因型不同，再生率不高，因此不能進行遺傳轉化其次，是關于基因沉默和丟失的問題，外源基因整合到受體以后經常表現出不表達或者丟失等現象，這是一個很普遍的問題另外，移栽成活率不高，即使獲得轉化植株，但由于移栽不能成活，致使不能大面積應用生產，理論與實際難以結合5存在問題245存在問題目前，蘋果轉基因研究進入瓶頸階段。第一，轉化方法單一，主要使用農桿菌介導法第二，轉基因技術的轉化效率很低

Puite等用農桿菌介導的嘎拉、金帥、E1star的轉化效率分別為0.7%～8.0%，0.2%～6.0%,0.4