DNA甲基化在肺癌順鉑耐藥中的研究進(jìn)展

DNA甲基化在肺癌順鉑耐藥中的研究進(jìn)展

孫瑾喆陳駿在21世紀(jì)，肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤性疾病[1]，我國肺癌發(fā)病率和死亡率也在逐年攀升[2]?；熓峭砥诜伟┑闹匾委熓侄?，順鉑（cisplatin,DDP）則是臨床上最活躍的抗癌藥物之一，含鉑雙藥化療是無驅(qū)動基因突變患者的主要一線治療[3,4]，但順鉑耐藥限制了其臨床應(yīng)用，成為肺癌治療亟待解決的問題之一。因此了解順鉑耐藥的分子機(jī)制、尋找預(yù)測標(biāo)記物、開發(fā)更有效的藥物來逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥是必要的。隨著甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展和表觀遺傳學(xué)研究的深入，學(xué)者們逐漸認(rèn)識到DNA甲基化在腫瘤耐藥過程中發(fā)揮著重要作用。在肺癌中常伴隨著DNA異常甲基化，研究者[5,6]發(fā)現(xiàn)共有372個基因在順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP中表現(xiàn)出高甲基化，這些基因參與了最基本的生命過程，如細(xì)胞增殖、凋亡等。因此，本文重點(diǎn)描述DNA甲基化與肺癌DDP耐藥的相關(guān)機(jī)制，綜述近年來的研究熱點(diǎn)基因，總結(jié)既往的研究成果，為進(jìn)一步研究提供思路和方向。1肺癌DDP耐藥機(jī)制含鉑雙藥化療一直是無驅(qū)動基因突變的轉(zhuǎn)移性肺癌治療的基石[4]，Schiller等[7]對DDP聯(lián)合三代化療藥物（如紫杉醇、多西他賽）在轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC）患者中進(jìn)行研究，結(jié)果顯示反應(yīng)率為15%-20%，總生存期（overallsurvival,OS）為7個月-8個月。越來越多的證據(jù)表明，化療的一些抗腫瘤活性可能是通過免疫介導(dǎo)。特別是，化療被認(rèn)為能在腫瘤細(xì)胞上誘導(dǎo)更多的程序性死亡配體1（programmedcelldeathligand1,PD-L1）表達(dá)，并增加腫瘤抗原的呈遞[8,9]，這也是將含鉑化療與免疫治療相結(jié)合的原理。因此，即使在免疫和靶向治療的時代，以DDP為基礎(chǔ)的化療仍然是中晚期肺癌的一線治療方案[3,10]。DDP屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，具有細(xì)胞毒性。它含有類似烷化劑的雙功能基團(tuán)，其抗腫瘤的主要機(jī)制是作用于DNA形成鏈間及鏈內(nèi)交聯(lián)的DDP-DNA復(fù)合物，造成DNA損傷或干擾DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，還可與核蛋白及胞漿蛋白結(jié)合，抑制RNA與蛋白質(zhì)合成[11]。然而，長期使用DDP不可避免會出現(xiàn)耐藥，約30%初次及70%多次DDP化療的患者會出現(xiàn)耐藥[12]。研究[13,14]表明，DDP耐藥是肺癌治療失敗的關(guān)鍵原因之一。DDP的耐藥機(jī)制復(fù)雜，主要包括：（1）影響DNA損傷修復(fù)，如DNA錯配修復(fù)基因（mismatchrepair,MMR）缺陷引起DNA損傷耐受；（2）影響細(xì)胞內(nèi)藥物的積累，如通過ATP結(jié)合盒（ATP-bindingcassettetransporter,ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員介導(dǎo)的DDP排泄增加和攝取減少；（3）“逃避”細(xì)胞凋亡信號，如Bcl-2蛋白家族、腫瘤抑制蛋白p53表達(dá)改變使細(xì)胞凋亡受到抑制等；（4）刺激生存信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響與DDP誘導(dǎo)細(xì)胞死亡沒有明顯聯(lián)系的分子途徑，如腫瘤干細(xì)胞的形成和腫瘤微環(huán)境的改變[15,16]。但是，目前還沒有任何一種機(jī)制能準(zhǔn)確、完全地解釋DDP的耐藥性。隨著探索的不斷深入，越來越多的研究[5,6]發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性耐藥腫瘤中存在著耐藥基因的表達(dá)異常，大多數(shù)都是由DNA甲基化異常所導(dǎo)致。此外，耐藥模型研究[17]也顯示，細(xì)胞毒藥物產(chǎn)生作用后腫瘤細(xì)胞的某些耐藥基因會發(fā)生DNA甲基化，促進(jìn)耐藥的產(chǎn)生。因此，DNA異常甲基化可能在肺癌DDP耐藥中起非常重要的作用。2DNA甲基化2.1DNA甲基化的概念表觀遺傳學(xué)是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平的變化[18]，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，與DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡等關(guān)鍵過程相關(guān)。DNA甲基化是指基因組胞嘧啶-鳥嘌呤（CpG）二核苷酸在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族（DNAmethyltransferases,DNMTs）的催化下將S-腺苷酸甲硫氨酸（S-adenosinemethionine,SAM）上的甲基轉(zhuǎn)移到DNA分子上，使基因啟動子區(qū)CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’甲基胞嘧啶的過程[19]。CpG二核苷酸在基因組中的分布不均勻，出現(xiàn)頻率較高的一段區(qū)域被稱為CpG島（CpGisland,CGI）[20]。在人類中，CGI一般存在于基因組的第1外顯子區(qū)和啟動子區(qū)[21]，具有調(diào)控基因表達(dá)的作用。在腫瘤中，盡管基因組整體低甲基化，某些基因仍會由于調(diào)控區(qū)域CGI的高甲基化而失活，而在非惡性組織中則是未甲基化的[22]。DNA異常高甲基化往往能夠通過降低腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性繼而對該基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，例如表達(dá)降低或沉默，從而間接誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和耐藥。2.2DNA甲基化的檢測DNA甲基化是當(dāng)今腫瘤研究的熱點(diǎn)，其檢測方法也逐步得到完善。精準(zhǔn)破譯DNA在基因組上的位置信息有助于闡明DNA甲基化的生物學(xué)功能[23]。最經(jīng)典的是亞硫酸鹽介導(dǎo)法[24]，除此之外，還有酶促甲基化測序法和TET輔助吡啶硼烷測序法等[25]，但上述方法較容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，存在一定誤差[26,27]。近年來隨著第三代測序技術(shù)的興起出現(xiàn)了更有潛力的檢測技術(shù)，如納米孔測序可以直接對DNA甲基化進(jìn)行定位，但仍處于發(fā)展階段，需要進(jìn)一步優(yōu)化檢測條件以較好地維持酶活性和穩(wěn)定性[28]。在分析微量樣品時可采用單分子實(shí)時測序[29]，該方法具有測序通量高、成本低、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，但仍需解決熒光信號干擾等問題。3DNA甲基化介導(dǎo)肺癌DDP耐藥的機(jī)制目前，在肺癌DDP耐藥方面研究最為集中和深入的甲基化基因有MMR、ABC、RAS相關(guān)區(qū)域家族1A基因（Rasassociationdomainfamily1Agene,RASSF1A）和編碼鈣黏蛋白超家族的基因等。它們介導(dǎo)肺癌DDP耐藥的機(jī)制不同，因此開展深入的研究對肺癌的治療、逆轉(zhuǎn)DDP耐藥具有重要意義。3.1MMR與DDP敏感細(xì)胞相比，DDP耐藥細(xì)胞顯示出更強(qiáng)大的DNA修復(fù)能力來消除DDP誘導(dǎo)的DNA損傷[30]。DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)是細(xì)胞復(fù)制的一種修復(fù)機(jī)制，能夠特異性識別DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的堿基錯配、缺失錯配和插入。其存在為DNA復(fù)制的高保真性和遺傳物質(zhì)的完整性與穩(wěn)定性提供了保障。研究[31]發(fā)現(xiàn)，MMR還參與了細(xì)胞凋亡與增殖的調(diào)控。到目前為止共發(fā)現(xiàn)了9個錯配修復(fù)功能基因，其中hMLH1、hMSH2最為重要。研究[32]表明hMLH1啟動子甲基化可導(dǎo)致體外和體內(nèi)DDP耐藥的發(fā)生，目前機(jī)制尚不明確。有研究者[33]認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞hMLH1甲基化時，細(xì)胞不能有效識別DDP介導(dǎo)的DNA損傷，受損細(xì)胞不會停留在G2期，或者抑制p53/非p53凋亡途徑，繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制，從而表現(xiàn)為耐藥。hMLH1甲基化會增加基因組的不穩(wěn)定性，引起基因功能喪失，產(chǎn)生對DDP耐受的突變體。需要注意的是，盡管hMSH2也在減少基因突變和維護(hù)基因穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，但是目前沒有關(guān)于其甲基化與肺癌DDP耐藥的相關(guān)性研究。3.2ABCDDP在細(xì)胞內(nèi)的積累減少是耐藥的主要原因之一。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族是一類三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate,ATP）依賴性藥物外排泵，通過減少細(xì)胞中的藥物積累使腫瘤細(xì)胞對多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥[34]。多藥耐藥相關(guān)蛋白（multi-drugresistanceassociatedproteins,MRPs）、P-糖蛋白（P-glyeoproteinn,P-gp）等經(jīng)典的多藥耐藥蛋白均屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。MRPs在正常組織中主要分布在內(nèi)膜系統(tǒng)上，表達(dá)量低。相反，MRPs在肺癌組織中主要位于細(xì)胞膜且表達(dá)升高[35]。DDP與谷胱甘肽偶聯(lián)成轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物后被MRPs識別，通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低進(jìn)而導(dǎo)致耐藥。因此DDP耐藥與MRPs的表達(dá)有緊密的聯(lián)系[36]。多藥耐藥基因1（multidrugresistancegene1,MDR1）編碼的P-gp過度表達(dá)也是化療耐藥的主要機(jī)制之一，與人肺腺癌細(xì)胞DDP耐藥相關(guān)[34]。MDR1基因啟動子低甲基化造成基因表達(dá)過度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生由P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥[37]。在肺癌細(xì)胞中MDR1基因和MRP啟動子附近CpG含量豐富[38]，因此針對兩者進(jìn)行DNA甲基化的研究對明確及逆轉(zhuǎn)肺癌DDP耐藥具有重要意義。逆轉(zhuǎn)MDR的策略主要集中在抑制或調(diào)控P-gp的活性，有研究[39,40]顯示，大黃素和橙皮素可以通過抑制P-gp的表達(dá)逆轉(zhuǎn)肺腺癌細(xì)胞的DDP耐藥，可能與核因子（nuclearfactor,NF）-κB通路相關(guān)。3.3RASSF1ARASSF1A編碼Ras效應(yīng)蛋白，是一種被廣泛研究的抑癌基因，具有調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用。RASSF1A因異常高甲基化失活最早在肺癌中被發(fā)現(xiàn)，其在NSCLC中的甲基化率為63%，在小細(xì)胞肺癌（smallcelllungcancer,SCLC）中更是高達(dá)80%，是人類腫瘤中甲基化頻率最高的基因之一[41-43]。盡管目前沒有關(guān)于RASSF1A甲基化與肺癌DDP耐藥的相關(guān)研究，但有學(xué)者[42]發(fā)現(xiàn)RASSF1A的甲基化狀態(tài)在A549和A549/DDP之間存在明顯差異，使用去甲基化劑會明顯降低A549/DDP的活力，以劑量依賴的方式誘導(dǎo)A549/DDP凋亡。其機(jī)制有可能是RASSF1A通過滅活Keap1-Nrf2通路激活自噬，或激活Ras通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)對DDP的敏感性[44,45]，這提示了該基因甲基化與DDP耐藥具有潛在聯(lián)系。3.4鈣黏蛋白超家族編碼基因CDH13基因編碼T-cadherin蛋白[46]，同時也是一種抑癌基因，具有負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的作用，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Feng等[47]發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，NSCLC組織中CDH13啟動子區(qū)呈現(xiàn)高度甲基化[48]。去甲基化恢復(fù)CDH13的表達(dá)后可以逆轉(zhuǎn)肺癌DDP耐藥，隨著甲基化抑制劑濃度的升高，CDH13的非甲基化狀態(tài)增強(qiáng)，可加強(qiáng)DDP對A549/DDP的凋亡作用。CDH1編碼E-cadherin蛋白，研究顯示DDP耐藥細(xì)胞中的甲基化頻率較DDP敏感細(xì)胞明顯升高[49]，并且DDP對CDH1陰性的SCLC分型具有良好的療效[50]，但其機(jī)制尚不明確。3.5胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族（insulin-likegrowthfactor-bindingprotein,IGFBPs）IGFBP-3是IGFBPs家族含量最豐富的蛋白，其基因啟動子異常高甲基化與NSCLC患者的DDP獲得性耐藥有關(guān)，部分機(jī)制是啟動子甲基化導(dǎo)致該基因表達(dá)喪失并激活PI3K/Akt通路[51,52]。有研究[53]分析了NSCLC標(biāo)本的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IGFBP-3基因啟動子未甲基化有延長I期患者無病生存期（diseasefreesurvival,DFS）的趨勢。因此治療前IGFBP-3的甲基化狀態(tài)可能是DDP療效的臨床生物標(biāo)志物和預(yù)測因子，有助于篩選從DDP治療中受益的患者。除了上述基因和蛋白家族外，還有一部分研究較少的基因，其甲基化也與肺癌DDP耐藥相關(guān)（表1）[54-60]。傳統(tǒng)肺癌化療方案的制定取決于腫瘤的分型和腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis,TNM）分期，但是同一病理類型的患者療效有時相差甚遠(yuǎn)。隨著研究的深入，證實(shí)了基因甲基化與表達(dá)水平的檢測可以作為預(yù)測肺癌DDP耐藥的生物學(xué)標(biāo)志應(yīng)用于臨床，多個標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用可以更準(zhǔn)確地篩選出DDP敏感患者，這些標(biāo)志物甚至有望成為逆轉(zhuǎn)DDP耐藥的治療靶點(diǎn)輔助治療。表1與肺癌順鉑耐藥相關(guān)的DNA甲基化基因Tab1DNAmethylationgeneslinkedtocisplatinresistanceinlungneoplasms4去甲基化的治療策略DNA甲基化是一種可逆的表觀遺傳學(xué)修飾方式，因此研究DNA甲基化與肺癌DDP耐藥的關(guān)系有望成為逆轉(zhuǎn)耐藥的新方向。由于肺癌中的異常甲基化基因多表現(xiàn)高甲基化，因此，目前針對肺癌DNA甲基化的治療策略集中在去甲基化上。公認(rèn)的去甲基化治療策略主要包括DNMTs抑制劑、靶向下調(diào)基因表達(dá)和聯(lián)合治療。4.1DNMTs抑制劑在腫瘤中常檢測到DNMTs高表達(dá)，因此抑制DNMTs活性可作為腫瘤治療的新思路[61]。目前，5-氮-2-脫氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine,5-Aza-dc）是體外最常用且作用最強(qiáng)的一種甲基化抑制劑，其機(jī)制是抑制DNMTs從而抑制基因甲基化[62]。低劑量5-Aza-dc可以部分逆轉(zhuǎn)A549對DDP的耐藥性，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)低劑量5-Aza-dc去除了部分hMLH1高甲基化，上調(diào)了mRNA和蛋白的表達(dá)。其臨床藥物如地西他濱（Decitabine,DAC）已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FoodandDrugAdminstration,FDA）批準(zhǔn)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。在關(guān)于肺癌的臨床試驗中也發(fā)現(xiàn)DNMTs抑制劑具有一定的療效。一項關(guān)于DAC治療肺癌的I期臨床試驗[63]顯示，36%的患者中觀察到靶基因誘導(dǎo)。此外，一些心律失常藥物如普魯卡因胺也具有去甲基化作用，雖然作用與DAC相比較差，但已通過FDA認(rèn)證并可用于治療。還有一些靶點(diǎn)仍處于體外細(xì)胞和動物實(shí)驗階段[64]，需要進(jìn)一步驗證。4.2靶向下調(diào)基因表達(dá)FDA認(rèn)證了幾種DNA甲基化抑制劑，如DAC、Azacitidine等，但是隨之而來的各種副作用也限制了它們的臨床應(yīng)用，靶向治療可能最大限度降低廣譜藥物副作用。RNA干擾（RNAinterference,RNAi）技術(shù)通過靶向降解信使RNA從而選擇性地抑制基因表達(dá)[65]，外源性引入小干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）可誘導(dǎo)RNAi的發(fā)生，該過程遵循堿基互補(bǔ)配對原則[66]。該項技術(shù)沉默DNMTs和一些DNA啟動子區(qū)基因表達(dá)也能達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的效果。反義寡核苷酸是一類人工合成的反義表達(dá)載體的寡核苷酸片段，導(dǎo)入細(xì)胞或個體后通過序列特異地與靶基因DNA或mRNA結(jié)合而抑制該基因表達(dá)。這兩者均為基因沉默技術(shù)，可以改變DNA甲基化狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥?，F(xiàn)有一項正在進(jìn)行的I期/IB期研究，在NSCLC等腫瘤患者中靜脈注射NBF006（一種帶有siRNA的藥物成分），研究的主要終點(diǎn)是藥物的安全性、藥代動力學(xué)及初步療效（NCT03819387）。雖然這兩種技術(shù)在操作上相對簡單，基因沉默效果可靠[67]，但是它們的穩(wěn)定性和靶向性較差，需要研究者們繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)核酸化學(xué)修飾的研究。隨著基因編輯技術(shù)的興起，CRISPR（clusteredregularyinterspacedshortpalindromicrepeats）的應(yīng)用也越來越廣泛，CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了基因研究的進(jìn)展，研究者通過CRISPR/dCas9-Tet1系統(tǒng)靶向去甲基化NNTCpG島可顯著降低其DNA甲基化水平，抑制A549/DDP細(xì)胞的DDP耐藥性?；贑RISPR的DNA甲基化編輯NNT可能是治療肺癌DDP耐藥的潛在治療方法[56]。CRISPR/dCas9的獨(dú)特優(yōu)勢是它能夠同時針對多個位點(diǎn)進(jìn)行靶向的去甲基化，但是存在著一定的脫靶效應(yīng)，提高識別效率將是該技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵[68]。4.3聯(lián)合用藥由于腫瘤耐藥是復(fù)雜、多機(jī)制的過程，因此聯(lián)合治療可能會獲得更好的療效。雖然研究顯示DNMTs抑制劑對肺癌具有一定的療效，但單獨(dú)應(yīng)用在肺癌治療中仍然受限，根源在于療效的有限性和較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如出現(xiàn)劑量限制性中性粒細(xì)胞減少癥[63]。DNMT抑制劑聯(lián)合其他藥物會有更好的療效。最常見的是DNMTs抑制劑聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤治療，目前一項四氫尿酸-DAC聯(lián)合帕博麗珠單抗治療晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC的臨床研究正在進(jìn)行中（NCT02664181）。另外，將DNMT抑制劑與組蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases,HDAC）抑制劑聯(lián)合使用也是一種有前景的治療方案，兩者可以發(fā)揮不同表觀遺傳學(xué)作用。在一項DNMTs抑制劑阿扎胞苷和HDAC抑制劑恩替諾特聯(lián)合治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的I期/II期試驗[69]中，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)用可以降低靶基因（RASSF1A、CDH13等）甲基化水平，增加后續(xù)化療的療效，延長肺癌患者的OS。還有一項臨床研究將DAC與丙戊酸聯(lián)用，研究目的是確定其在NSCLC中的安全性和耐受性（NCT00084981），遺憾的是該項研究沒有公布最終結(jié)果。盡管既往的研究在逆轉(zhuǎn)肺癌DDP耐藥方面取得了一些進(jìn)展，但其毒副作用依然突出，例如在一項試驗[69]中，所有的患者均發(fā)生至少1例與治療相關(guān)的不良事件，28%的患者出現(xiàn)了3級或4級不良反應(yīng)，其中以疲勞和血液學(xué)毒性最常見，并