鹽酸博安霉素脂質(zhì)體的制備及表征

鹽酸博安霉素脂質(zhì)體的制備及表征王金晶;張芹消晗;陳立江;李麗;張文君;李鐵福瀏宇【摘要】目的探討制備方法對(duì)博安霉素脂質(zhì)體包封率的影響,考察其制備的影響因素，優(yōu)化處方工藝,并對(duì)其特性進(jìn)行表征.方法分別采用乙醇注入法和逆向蒸發(fā)法制備博安霉素脂質(zhì)體(boanmycinliposomes,BAM-Ls),確定最終工藝及處方.并對(duì)其包封率、粒徑、Zeta電位和形態(tài)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).結(jié)果逆向蒸發(fā)法制備BAM-Ls時(shí)藥物包封率明顯高于乙醇注入法,最終處方磷脂濃度為10mg/mL、磷脂膽固醇比為4:1(W/W)、水/乙醚比為1:3(V/V)時(shí)，所得脂質(zhì)體包封率最高，約為30%.粒徑為150nm,Zeta電位為-22.8mV,7d內(nèi)脂質(zhì)體穩(wěn)定性良好結(jié)論逆向蒸發(fā)法制備的BAM-Ls理化性質(zhì)及穩(wěn)定性良好.【期刊名稱】《中國抗生素雜志》【年(卷)，期】2014(039)003【總頁數(shù)】5頁(P220-223,233)【關(guān)鍵詞】博安霉素;乙醇注入法;逆向蒸發(fā)法;脂質(zhì)體【作者】王金晶;張芹消晗;陳立江;李麗;張文君;李鐵福瀏宇【作者單位】遼寧大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110036;湖北省鐘祥市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，鐘祥431900;遼寧中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，沈陽110032;遼寧大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110036;遼寧大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110036;遼寧大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110036;沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院，沈陽110016;遼寧大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110036【正文語種】中文【中圖分類】R978.1博安霉素（boanmycin,BAM）,是從我國浙江平陽土壤中分離得到的輪枝鏈霉菌平陽新變種產(chǎn)生的抗癌有效物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與國夕卜報(bào)道的博萊霉素A6（bleomycinA6,BLMA6）完全一致，屬博萊霉素類抗腫瘤抗生素。為我國自行研制開發(fā)的國家I類新藥，2002年，以凍干粉形式正式上市銷售。BAM分子式為C60H96N20O21S2?nHCl，分子量1497.66，極易溶于水，溶于甲醇，不溶于乙醚、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑。在BAM對(duì)原發(fā)性肝癌的II期103例臨床研究中，單藥介入有效率30.8%，聯(lián)合用藥介入有效率42.1%，表明BAM對(duì)肝癌具有較為顯著的療效［1-4］。目前，除博安霉素凍干粉制劑，尚未見其它劑型的研究報(bào)道。臨床研究表明，其肌注后吸收迅速，血藥達(dá)峰的時(shí)間18.6min,血藥濃度0.20pg/mL,240min后降為零，主要毒副反應(yīng)表現(xiàn)為肺纖維化。大劑量使用時(shí)，易造成大鼠腎臟損傷，腎功能生化指標(biāo)異常升高以及組織形態(tài)學(xué)病變。將其制成脂質(zhì)體制劑，利用脂質(zhì)體對(duì)藥物的保護(hù)作用，延長其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，提高生物利用度。同時(shí)，利用脂質(zhì)體的被動(dòng)肝靶向性，提高藥物在肝臟的分布濃度，降低對(duì)其它組織器官的毒副作用。1.1藥品與試劑注射用博安霉素凍干粉（遼源市迪康藥業(yè)有限責(zé)任公司，純度74.5%）;博安霉素對(duì)照品（遼源市迪康藥業(yè)有限責(zé)任公司，純度78.6%）；大豆卵磷脂（EPCS，德國Lipoid公司，純度98%）;膽固醇（Chol,天津市博迪化工有限公司）；曲拉通（TritonX-100，上海源葉生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純。1.2儀器PB-10型pH計(jì)（德國賽多利斯股份公司）；FA1004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Scientz-11D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（新芝生物科技股份有限公司）；L-7110高效液相色譜儀（日本日立公司）；N-1000型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；CS120GXL超速離心機(jī)(日本日立公司)。2.1博安霉素脂質(zhì)體的制備乙醇注入法：將EPCS和Chol溶于20mL乙醇中，在一定溫度下，注入到10mL快速攪拌的BAM水溶液中，減壓蒸發(fā)除去乙醇后，定容至10mL，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理4min，分別過0.8及0.45pm微孔濾膜，即得BAM-Ls溶液。逆向蒸發(fā)法：精密稱取處方量的EPCS和Chol溶于10mL氯仿中，超聲溶解，減壓蒸發(fā)成膜，加入無水乙醚30mL,震蕩溶解，取BAM適量溶于10mL蒸餾水中，將其加入上述乙醚溶液中，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理2min，得到均一溶液，減壓蒸發(fā)至乙醚完全揮散，蒸餾水定容至10mL,超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理4min，分別過0.8及0.45pm微孔濾膜，得到BAMLs溶液。2.2HPLC分析方法[5-6]色譜柱：AgilentEclipseXDB-C18(150mmx4.6mm,5pm);流動(dòng)相：水相：有機(jī)相=72:28(水相：0.055M乙烷磺酸鈉溶液，加入0.08M醋酸，混勻后用氨水調(diào)pH至4.3；有機(jī)相：甲醇-乙腈=3:1)；流速：1.0mL/min，檢測波長：291nm；進(jìn)樣量：20pL。2.3博安霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取BAM對(duì)照品13.2mg于10mL量瓶中，加蒸餾水定容，混勻，BAM最終濃度約為1mg/mL,作為BAM儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量，以蒸餾水稀釋至濃度依次為30,60,120,240和480pg/mL的溶液，分別吸取20pL上述溶液注入到色譜儀中，測定藥物峰面積。并以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)作線性回歸，回歸方程為A=10328C-118948,(r=0.9999),結(jié)果表明BAM在濃度范圍30~480pg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.4博安霉素脂質(zhì)體包封率的測定精密量取BAM-Ls4.0mL,于55000r/min離心1h，取上清液HPLC法測定游離藥物濃度。另取BAM-Ls1.0mL，加入10%TritonX-100的70%乙醇水溶液定容至5mL，水浴超聲至溶液澄清透明，HPLC法測定脂質(zhì)體溶液藥物濃度，包封率計(jì)算按照Eq2-1計(jì)算其中Ci為未被脂質(zhì)體包封的游離藥物量（或濃度），Ct為總的藥物量（或濃度）。2.5博安霉素脂質(zhì)體粒徑、Zeta電位的測定將制得的BAM-Ls用去離子水適當(dāng)稀釋，置納米粒度測定儀的石英測量池和毛細(xì)管小池中，分別測定其粒徑和Zeta電位，每份樣品平行測定3次。3.1乙醇注入法制備BAM-Ls的影響因素考察EPCS濃度考察在確定了BAM-Ls的處方構(gòu)成以后，接下來對(duì)EPCS的濃度進(jìn)行了篩選，并采用乙醇注入法分別制備不同磷脂濃度的脂質(zhì)體，包封率結(jié)果見圖3。EPCS與Chol比例考察將EPCS濃度固定為20mg/mL，分別考察EPCS和Chol之間比例對(duì)包封率的影響，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，當(dāng)EPCS/Chol比為4:1時(shí)，包封率最高，故按照此比例進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。3.1.3水相與有機(jī)相比例考察EPCS濃度為20mg/mL時(shí)，考察水相與有機(jī)相乙醇的比例對(duì)包封率的影響，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，水相和乙醇的比例對(duì)藥物包封率影響較大，由圖1可知，當(dāng)二者比例達(dá)到1:1時(shí)，包封率達(dá)到最大值。3.1.4攪拌速度的影響當(dāng)EPCS濃度為20mg/mL，乙醇和水相體積比1:1時(shí)，考察攪拌速度對(duì)藥物包封率的影響，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)速在300~600r/min之間變化時(shí)，藥物包封率波動(dòng)不大，故認(rèn)為磁力攪拌速度對(duì)包封率無明顯影響。3.2逆向蒸發(fā)法制備BAM-Ls試驗(yàn)中逆向蒸發(fā)法的工藝條件按照文獻(xiàn)［7］中的最優(yōu)化條件進(jìn)行，在乙醚和水相體積比3:1時(shí)，分別考察了不同磷脂濃度對(duì)包封率的影響。結(jié)果見圖3。由結(jié)果可以看出，逆向蒸發(fā)法對(duì)藥物的包封率顯著高于乙醇注入法，由此可見，同乙醇注入法相比較，使用逆向蒸發(fā)法更適用于水溶性藥物的包封，這也與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符［8］。3.3博安霉素脂質(zhì)體的表彳正使用逆向蒸發(fā)法，按優(yōu)化后的處方制備BAMLs，并考察其表征。3.3.1粒徑、Zeta電位測定按“2.5”項(xiàng)下方法，測得BAM-Ls的平均粒徑為(153±2.3)nm，Zeta電位為(-22.8±1.11)mV。3.3.2脂質(zhì)體形態(tài)觀察將制備的脂質(zhì)體用蒸餾水適當(dāng)稀釋，取一滴于專用銅網(wǎng)上，靜置后用3%磷鎢酸負(fù)染色，用濾紙吸去多余的染色液后，透射電鏡觀察粒子形態(tài)，結(jié)果見圖4。由圖4可見，BAM-Ls為球形粒子且呈單分散分布，粒徑范圍小于200nm，且其夕卜觀圓整，大小均勻，且可以清晰地觀察到所制備脂質(zhì)體為單室結(jié)構(gòu)。3.3.3穩(wěn)定性考察將制備的BAM-Ls于0~4°C冰箱保存，分別在第0、1、2、3、4、5、6和7d取樣測定包封率和粒徑變化，結(jié)果見表2。4討論脂質(zhì)體的制備方法眾多，從最初的薄膜分散法到新近產(chǎn)生的單相溶液凍干法。在制備某一藥物的脂質(zhì)體制劑時(shí)，首先要考慮該藥物的理化性質(zhì)，主要包括分子量(MW)、溶解度(S)、油水分配系數(shù)(logP)、電離常數(shù)(pKa)。博安霉素極易溶于水，屬于分步電離的弱堿性藥物，其電離常數(shù)pKa>7.4、4.7和2.7。本文首先采用被動(dòng)載藥法-乙醇注入法嘗試制備BAMLs，該方法對(duì)BAM的包封率極低（小于10%）。Jaafar-Maalej［8］等研究了乙醇注入法對(duì)制備水溶性藥物（阿糖胞苷）和脂溶性藥物（丙酸倍氯米松）脂質(zhì)體的包封率比較。他們使用乙醇注入法制備脂質(zhì)體粒徑范圍在80~170nm。結(jié)果表明，磷脂和膽固醇的量顯著影響藥物包封率。對(duì)制備工藝進(jìn)行單因素考察后，脂溶性藥物包封率接近100%，而水溶性藥物僅為16%。但乙醇注入法憑借其操作簡單、重現(xiàn)性好、避免了使用有機(jī)溶劑，易于實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，還是制備成為了制備脂質(zhì)體制劑的首選方法之一。1978年Szoka等提出逆向蒸發(fā)法［7］，研究人員通過該方法制備出了內(nèi)水相體積大且包封率高的脂質(zhì)體，其水相體積比小單室脂質(zhì)體高30倍。該方法的提出，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大多數(shù)水溶性藥物的包封，并顯著提高藥物的包封率。逆相蒸發(fā)法的是脂質(zhì)體領(lǐng)域里一個(gè)里程碑式的重大發(fā)現(xiàn)，其制備的大單室脂質(zhì)體尤其適用于水溶性藥物包封。有機(jī)相和水相比例在3:1時(shí)，包封率最高。在制備過程中，磷脂濃度較低時(shí)，很難看到明顯的凝膠態(tài)形成，當(dāng)磷脂濃度較高時(shí)，能夠觀察到凝膠態(tài)的產(chǎn)生，但是并未觀察到凝膠層的塌陷。脂質(zhì)體的制備與圓底燒瓶的大小、水相和有機(jī)量的體積比、真空度等因素均有很大關(guān)系。實(shí)驗(yàn)表明，逆向蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體粒徑差異較大，每次制備后都需測定粒徑。粒徑范圍在300~1000nm之間不等。當(dāng)磷脂濃度過大超過60mg/mL時(shí)，制備出的脂質(zhì)體粘度較大，不能完全轉(zhuǎn)移，同時(shí)過膜困難，會(huì)造成磷脂較大損失，導(dǎo)致包封率下降。脂質(zhì)體的粒徑大小和形態(tài)也能夠影響藥物的包封率，對(duì)于水溶性藥物，粒徑大的脂質(zhì)體的內(nèi)水相容積大，包封藥物較多。一般常用的減小粒徑的方法主要有超聲法和高壓均質(zhì)法。本研究中嘗試使用微射流減小脂質(zhì)體粒徑，結(jié)果表明，經(jīng)過微射流次數(shù)不同時(shí)，脂質(zhì)體粒徑上下波動(dòng)較大。將制備的脂質(zhì)體經(jīng)過微射流10~15次時(shí)，能夠得到粒徑較為均勻的脂質(zhì)體溶液，但是由于實(shí)驗(yàn)室樣品量較少，故本研究中采用了超聲法。然而探頭式超聲時(shí)間過長造成局部過熱，會(huì)引起脂質(zhì)的降解，所以試驗(yàn)中采用將樣品放在冰浴中以適當(dāng)功率進(jìn)行操作?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】KleesRF,SalasznykRM,VandenbergS,etal.Laminin-5activatesextracellularmatrixproductionandosteogenicgenefocusinginhumanmesenchymalstemcells[J].MatrixBiol,2007,26(2):106-114.馮奉儀，周立強(qiáng).國產(chǎn)一類抗癌新藥鹽酸博安霉素H期臨床研究[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),1999,21(4):247-251.湯昊,楊小平.博安霉素誘導(dǎo)人食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡及其對(duì)細(xì)胞周期的影響[J].癌癥,2002,21(8):855-859.馮奉儀，周立強(qiáng),馬金蘭，等.國產(chǎn)一類抗癌新藥鹽酸博安霉素I期臨床研究[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),1996,18(2):143-146.LiuY,YooSD,FangL,etal.Determinationofboanmycininpharmaceuticalpreparationsbyasimpleandrapidion-pairLCmethod[J].Chromatographia,2009,70:643-646.LiuY,YooSD,FangL,etal.Ion-pairLC-UVmethodforthedeterminationofboanmycininmouseplasmaanditsapplicationtoapharmacokineticstudy[J].Chromatographia,2010,72:357-359.SzokaFJ,PapahadjopoulosD.Procedureforpreparationofliposomeswithlargeinte