硝化細(xì)菌的分離與鑒定

硝化細(xì)菌的分離與鑒定硝化細(xì)菌的分離與鑒定要篩選生長(zhǎng)速度快、硝化作用強(qiáng)的硝化細(xì)菌用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水處理。硝化細(xì)菌包括亞硝化菌和硝化菌兩個(gè)生理菌群，分別可將水中的氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和硝酸鹽。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)5周培養(yǎng)，亞硝化菌可使培養(yǎng)液中的氨氮含量下降到60%,硝化菌可使培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽含量下降到60%。實(shí)驗(yàn)可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中亞硝酸鹽的含量變化來(lái)測(cè)定細(xì)菌的氨轉(zhuǎn)化作用或硝化作用。關(guān)鍵詞：硝化菌，亞硝化菌，硝化作用，篩選。氨氮和亞硝酸鹽都是在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，且亞硝酸鹽還是強(qiáng)烈的治癌物質(zhì)，因此如何降解這兩種物質(zhì)，是科學(xué)工作者近年來(lái)的工作重點(diǎn)。硝化細(xì)菌是一類具有硝化作用的化能自養(yǎng)菌，包括硝化菌和亞硝化菌兩個(gè)生理菌群，其主要特性是自養(yǎng)性，生長(zhǎng)速率低，好氧性，依附性和產(chǎn)酸性等?？赏ㄟ^(guò)NH4+-NO2--NO3-這一過(guò)程將NH4+轉(zhuǎn)化為NO3-。能有效降低水體中氨氮及亞硝酸氮的含量，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及環(huán)境保護(hù)具有重要意義。硝化細(xì)菌是生物硝化脫氨中起主要作用的微生物，直接影響硝化效果和生物脫氨的效率。研究表明，水體中硝化細(xì)菌的濃度對(duì)生物脫氨具有十分重要的意義，由于大多數(shù)硝化細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，硝化及脫氨效果欠佳，處理水產(chǎn)養(yǎng)殖污水的效果不是很好。因此篩選出生長(zhǎng)速率高硝化作用強(qiáng)度大的硝化細(xì)菌有很大的用途。本文對(duì)硝化細(xì)菌的研究主要在富集培養(yǎng)和固定化細(xì)胞方面，能夠有效提高硝化細(xì)菌的產(chǎn)率和硝化細(xì)菌的利用率。通過(guò)富集培養(yǎng)的硝化細(xì)菌濃度是未經(jīng)富集培養(yǎng)的12.5?20.0倍，利用細(xì)胞固定化技術(shù)可使氨氮去除率提高16.5個(gè)百分點(diǎn)。國(guó)外在硝化細(xì)菌的培養(yǎng)方面的研究已有一些專利技術(shù)，其中一些已形成工業(yè)化生產(chǎn)，但產(chǎn)品價(jià)格較昂貴，并且必須不斷向反應(yīng)器中補(bǔ)充流失的硝化細(xì)菌。硝化作用包括兩個(gè)步驟：氨轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，這兩個(gè)步驟分別由亞硝化菌和硝化菌完成，至今還未發(fā)現(xiàn)有能將氨直接轉(zhuǎn)化為硝酸鹽的細(xì)菌。氨和亞硝酸分別是亞硝化菌和硝化菌的唯一能源。對(duì)于硝化細(xì)菌來(lái)說(shuō)生長(zhǎng)環(huán)境中的溫度對(duì)其影響較大，pH值和鹽度的影響相對(duì)較小。大多數(shù)硝化細(xì)菌的合適生長(zhǎng)溫度為10?38。。高于20^時(shí)硝化細(xì)菌的活性較高，但超過(guò)38^消化作用將會(huì)消失。當(dāng)環(huán)境氣溫低于20。時(shí)，氨的轉(zhuǎn)化會(huì)受到影響?！阏J(rèn)為，適宜硝化菌和亞硝化菌生長(zhǎng)介質(zhì)的pH值分別為6.0?8.5和6.0?8.0。水體DO的高低影響到好氧、厭氧微生物的比例，大多數(shù)研究人員認(rèn)為DO的濃度應(yīng)當(dāng)控制在1.0?2.0mg/L,低于0.5mg/L時(shí)硝化作用明顯減弱。另外，碳氮比、堿度等對(duì)硝化及脫氨均有影響。本文中篩選硝化細(xì)菌的依據(jù)主要是生長(zhǎng)速率和硝化作用強(qiáng)度，生長(zhǎng)速率主要采用活菌計(jì)數(shù)，因?yàn)橄趸?xì)菌的液體培養(yǎng)基中有沉淀，用OD600測(cè)的值誤差較大。氨轉(zhuǎn)化效率和硝化作用強(qiáng)度主要用比色法測(cè)定，利用亞硝酸根的顯色反應(yīng)。亞硝化菌測(cè)定其培養(yǎng)液中亞硝酸根的增加量，硝化菌測(cè)定其亞硝酸根的減少量。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1菌種由海洋中分離得到1.1.2培養(yǎng)基亞硝化菌培養(yǎng)基(NH4)2SO40.5gNaCl0.3gFeSO4?7H2O0.03gK2HPO41gMgSO4?7H2O0.03gCaCl27.5g蒸餾水1000mlPH自然固體培養(yǎng)基加5%瓊脂石肖化菌培養(yǎng)基NaNO21gMgSO4?7H2O0.03gMnSO4?4H2O0.01gK2HPO40.75gNa2CO31gNaH2PO40.25g蒸餾水1000mlPH自然固體培養(yǎng)基加5%瓊脂肉湯培養(yǎng)基牛肉膏0.5%蛋白胨1%氯化鈉0.5%瓊脂2%1.1.3試劑牛肉浸膏上海長(zhǎng)陽(yáng)生化制藥廠蛋白月東上海東海制藥廠磷酸氫二鉀浙江臨平化工試劑廠磷酸二氫鈉南京化學(xué)試劑一廠磷酸氫二鈉南京化學(xué)試劑一廠氯化鈉南京化學(xué)試劑一廠MnSO4?4H2O南京化學(xué)試劑一廠瓊脂江蘇疾病預(yù)防控制中心微生物試劑廠(NH4)2SO4南京化學(xué)試劑一廠FeSO4?7H2O上海試劑二廠MgSO4?7H2O上海試劑四廠CaCl2華東師范大學(xué)化工廠Na2CO3上海虹光化工廠NaNO2淮安化工二廠磺胺酸天津瑞金特化學(xué)品有限公司a-萘胺上海泗聯(lián)化工廠1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1硝化細(xì)菌的分離將采集到的海水樣本分別放在兩個(gè)培養(yǎng)皿中，分別加入亞硝化菌液體培養(yǎng)基和硝化菌液體培養(yǎng)基，放在24°C地培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，然后取培養(yǎng)液在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分區(qū)劃線，得到單菌落，再挑取單菌落進(jìn)行分區(qū)劃線分離。1.2.2形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定將分離得到的單菌落分別接種到肉湯培養(yǎng)基的平板上看其是否生長(zhǎng)(硝化細(xì)菌是嚴(yán)格的自養(yǎng)菌，在肉湯培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng))。鏡檢觀察：?jiǎn)稳旧ㄔ谂囵B(yǎng)液中加入格利斯試劑，亞硝化菌培養(yǎng)液變紅即可判斷為陽(yáng)性，硝化菌的培養(yǎng)液需比色計(jì)算出其亞硝酸根濃度是否降低，才能判斷是否為硝化菌。1.2.3細(xì)菌的培養(yǎng)(搖瓶、發(fā)酵罐)(1)搖瓶培養(yǎng)：將初步鑒定是硝化細(xì)菌的菌落接種到搖瓶中20-28°C培養(yǎng)，200轉(zhuǎn)/分鐘，每隔五天取樣一次測(cè)硝化作用強(qiáng)度和菌濃度。(2)發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)5天的種子加入發(fā)酵罐中，于20-28C培養(yǎng)，其中pH控制在6.0以上。每隔12小時(shí)取樣測(cè)亞硝酸根濃度和菌濃度。1.2.4硝化作用測(cè)定試劑(1)格利斯試劑溶液I：稱取磺胺酸0.5g，溶于150ml醋酸溶液(30%)中，保存于棕色瓶中。溶液H：稱取a-萘胺0.5g，加入50ml蒸餾水中，煮沸后，緩緩加入30%的醋酸溶液150ml中，保存于棕色瓶中。(2)2%醋酸鈉溶液將2g無(wú)水醋酸鈉加入到100ml蒸餾水中，混勻溶解。方法☆標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制稱取4.500g分析純亞硝酸鈉于干燥的小燒杯中，加蒸餾水溶解后洗入100ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度定容，搖勻，溶液中NO2-的濃度為30mg/ml，用時(shí)稀釋至NO2-為0.03mg/ml。吸取NO2-標(biāo)準(zhǔn)液(NO2-0.03mg/ml)0、1、2、3、4、5ml,分別放入50ml容量瓶中，每一容量瓶NO2-濃度為0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0|jg/ml;各加入1ml格利斯試劑I,放置10分鐘，再加入1ml格利斯試劑H和1ml2%醋酸鈉溶液，顯色后稀釋至刻度。用分光光度計(jì)于520nm處比色，以濃度為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。☆培養(yǎng)液中NO2-測(cè)定亞硝化菌氨轉(zhuǎn)化作用測(cè)定取1ml培養(yǎng)液于50ml容量瓶中，加入1ml格利斯試劑I,放置10分鐘，再加入1ml格利斯試劑H和1ml2%醋酸鈉溶液，顯色后稀釋至刻度。用分光光度計(jì)于520nm處比色。硝化菌硝化作用強(qiáng)度測(cè)定取1ml培養(yǎng)液稀釋100倍(視培養(yǎng)液中NO2-濃度而定)，取稀釋后的培養(yǎng)液1ml于50ml容量瓶中，加入1ml格利斯試劑1,放置10分鐘，再加入1ml格利斯試劑H和1ml2%醋酸鈉溶液，顯色后稀釋至刻度。用分光光度計(jì)于520nm處比色O☆結(jié)果計(jì)算@標(biāo)準(zhǔn)曲線以濃度為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w得到方程y=ax+b@亞硝酸根濃度二，mg/mld=稀釋倍數(shù)1.2.5細(xì)菌濃度測(cè)定(1)取0.1ml培養(yǎng)液加到0.9ml生理鹽水中，混勻，就得到10-1的菌懸液，再取出0.1ml加到0.9ml生理鹽水中，得到10-2的菌懸液，同樣方法依次稀釋到10-3、10-4的菌懸液，具體情況視菌懸液濃度而定。(2)將稀釋好的菌懸液取0.1ml,與冷卻到501的瓊脂培養(yǎng)基混勻，于24°C培養(yǎng)5天，進(jìn)行計(jì)數(shù)。2結(jié)果2.1亞硝酸鹽濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線用亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)液，加入格利斯試劑，于752分光光度計(jì)上520nm處比色，以亞硝酸根濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)圖1。圖1亞硝酸鹽濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig1Thestandardcurveofnitritedetection2.2硝化細(xì)菌的鑒定2.2.1形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定一單染色法經(jīng)單染色法觀察，亞硝化菌為橢圓形球菌，體積較大；硝化菌體積較小。與文獻(xiàn)所述相同。見(jiàn)圖2和圖3。圖2亞硝化菌的形態(tài)Fig2Themorphologyofsub-nitrobacteria圖3硝化菌的形態(tài)Fig3Themorphologyofnitrobacteria2.2.2培養(yǎng)特征將挑選出來(lái)的菌落接種到肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，沒(méi)有生長(zhǎng)，可以認(rèn)為該菌為自養(yǎng)菌。（硝化細(xì)菌是嚴(yán)格的自養(yǎng)菌不能在肉湯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)）2.2.3硝化作用鑒定將亞硝化菌和硝化菌接種到液體培養(yǎng)基中，于24C培養(yǎng)5天，在亞硝化菌的培養(yǎng)液中加入格利斯試劑，溶液變紅可以判斷為亞硝化菌；將硝化菌的的培養(yǎng)液取出1ml稀釋100倍，加入格利斯試劑，于752分光光度計(jì)上比色，看其中的亞硝酸根含量減少，可以斷定為硝化菌。2.3氨轉(zhuǎn)化作用和硝化作用2.3.1亞硝化菌的氨轉(zhuǎn)化作用亞硝化菌經(jīng)過(guò)5周的搖瓶培養(yǎng)能使培養(yǎng)液中亞硝酸根的濃度能上升到300pl/ml以上，說(shuō)明其具有亞硝化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4亞硝化菌的氨轉(zhuǎn)化作用Fig4Theammoniaconversionofsubnitrobacteria2.3.2硝化菌的硝化作用硝化菌經(jīng)過(guò)10天左右的發(fā)酵培養(yǎng)可使發(fā)酵液中的亞硝酸根濃度下降40%左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5硝化菌的硝化作用Fig5Thenitrificationofnitrobacteria2.4硝化細(xì)菌的培養(yǎng)2.4.1發(fā)酵培養(yǎng)硝化細(xì)菌的pH值變化由于硝化細(xì)菌產(chǎn)酸，發(fā)酵罐中的pH值一直呈下降的趨勢(shì)，但是由于酸性環(huán)境不利于硝化細(xì)菌的硝化作用，所以pH值最好控制在6.0以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。2.4.2發(fā)酵培養(yǎng)硝化細(xì)菌溶氧的變化硝化細(xì)菌是一種好氧的自養(yǎng)菌，由于硝化細(xì)菌生長(zhǎng)速度緩慢，發(fā)酵液中的菌濃度一直較低，因此溶氧一直較高，最低時(shí)也有68%左右。在發(fā)酵后期隨著菌體的自溶，溶氧還有上升的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。圖6發(fā)酵罐培養(yǎng)硝化細(xì)菌的pH值變化曲線Fig6ThepHcurveofnitrobacteriacultivationinfermenter圖7發(fā)酵罐培養(yǎng)硝化細(xì)菌的DO值變化曲線Fig7TheDOcurveofnitrobacteriacultivationinfermenter2.4.3發(fā)酵培養(yǎng)硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線該生長(zhǎng)曲線由發(fā)酵液活菌計(jì)數(shù)得到，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)為含菌量的對(duì)數(shù)值。由該生長(zhǎng)曲線可以看出硝化細(xì)菌和一般的異養(yǎng)菌的不同，硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)較緩慢，其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期要5天左右才能到達(dá)，菌濃度也很低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。圖8發(fā)酵培養(yǎng)硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線Fig8Thegrowthcurveofnitrobacteria3討論3.1本研究的主要目的是篩選生長(zhǎng)速度快、硝化作用強(qiáng)度大的硝化細(xì)菌。主要步驟如下：采集水樣分離鑒定培養(yǎng)硝化作用測(cè)定菌種保存發(fā)酵培養(yǎng)細(xì)菌濃度測(cè)定3.2測(cè)定硝化作用強(qiáng)度的原理是：NO2-能與格利斯試劑反應(yīng)生成紫紅色化合物，此反應(yīng)不受NO3-N的干擾。因此可通過(guò)比色測(cè)定出培養(yǎng)基中亞硝酸的含量。3.3在搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的后期，菌的亞硝化率和硝化率都有所下降，可能的原因是培養(yǎng)液中的產(chǎn)物累積的太多，對(duì)亞硝化作用和硝化作用有抑制，特別是硝酸根對(duì)硝化作用的抑制，因此，對(duì)于硝化細(xì)菌最好采用連續(xù)培