MEI1基因可變剪切事件對(duì)蒙古馬精子生成的調(diào)控作用

MEI1基因可變剪切事件對(duì)蒙古馬精子生成的調(diào)控作用

崔迎迎，芒來(lái)*，李蓓*，特日格樂，趙一萍，任秀娟，宋連杰，蘇少鋒,3(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018；2.承德市農(nóng)林科學(xué)院，承德067000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特010031)可變剪切又叫選擇性剪切(alternativesplicing,AS)，普遍存在于真核生物體內(nèi)，是一種保守的生物學(xué)過(guò)程，指主要基因或者mRNA前體轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的RNA的外顯子以多種方式通過(guò)RNA剪切進(jìn)行重連，由此產(chǎn)生的不同mRNA可能被翻譯成不同的蛋白質(zhì)構(gòu)體。隨著RNA-Seq測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，在人類基因組中發(fā)現(xiàn)參與編碼蛋白質(zhì)的基因大約有21000個(gè)，約95%的基因可以發(fā)生可變剪切，且不同的可變剪切事件的調(diào)控方式也具有差異性[1-3]。因此，可變剪切對(duì)真核生物的生長(zhǎng)繁殖、信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)現(xiàn)象的研究有重要意義。基因篩選中發(fā)現(xiàn)，控制哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂同源重組過(guò)程的關(guān)鍵基因主要有SPO11、MSH4、MSH5、RAD51、DMC1、MLH1和EXO1等[4]，其中MEI1基因首次在胚胎干細(xì)胞化學(xué)誘變產(chǎn)生的不育小鼠體內(nèi)篩選分離，也是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)通過(guò)正向遺傳學(xué)方法確定的減數(shù)分裂特異性突變型基因，被初步描述為顯示雄性減數(shù)分裂缺陷的突變體。研究發(fā)現(xiàn)，MEI1被定位在人類的22號(hào)染色體和小鼠的15號(hào)染色體上，分別在睪丸組織和性腺中高表達(dá)[5]。MEI1基因發(fā)生突變不僅可以引起復(fù)發(fā)性葡萄胎，其雙等位基因突變也與早期胚胎阻滯和復(fù)發(fā)性著床失敗有關(guān)[6]；另外，Mathilde等[7]也發(fā)現(xiàn)，MEI1缺陷卵母細(xì)胞能夠受精并啟動(dòng)胚胎發(fā)育過(guò)程，但大多數(shù)在2～4細(xì)胞期停止發(fā)育。在減數(shù)分裂過(guò)程中，重組是由蛋白SPO11誘導(dǎo)的雙鏈斷裂(DSBs)形成而開始的，研究發(fā)現(xiàn)MEI1是一個(gè)包含BRCA1C端結(jié)構(gòu)域的蛋白，特異性調(diào)控減數(shù)分裂細(xì)胞周期，并在一些不依賴于SPO11DSBs重組修復(fù)的DNA修復(fù)事件中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是脊椎動(dòng)物精子發(fā)生過(guò)程中減數(shù)分裂前期DNADSBs形成所必需的[8-9]。綜上，MEI1基因參與調(diào)控精子生成和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程。睪丸作為雄性動(dòng)物的重要生殖器官，有產(chǎn)生精子和雄性生殖激素的作用。睪丸細(xì)胞包括間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞(SC)和生殖細(xì)胞，且均對(duì)精子發(fā)生起調(diào)控作用[10]。其中SC附著在曲細(xì)精管基膜上，包圍著不同生長(zhǎng)階段的生精細(xì)胞，內(nèi)含發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體和高爾基體等，有利于合成、運(yùn)輸多種促進(jìn)生精細(xì)胞發(fā)生所必需的營(yíng)養(yǎng)因子并參與構(gòu)成血睪屏障(blood-testisbarrier,BTB)[11-14]。研究發(fā)現(xiàn)，SC能促進(jìn)精索形成，為生物體青春期精子發(fā)生過(guò)程中的細(xì)胞生理和代謝提供支持，保證生殖細(xì)胞分化、減數(shù)分裂和向精子轉(zhuǎn)化過(guò)程的正常發(fā)生[15-16]。SC還通過(guò)活躍的自噬行為調(diào)節(jié)雄激素結(jié)合蛋白(ABP)代謝，為生精細(xì)胞提供高濃度雄激素環(huán)境[14]。此外，睪丸SC作為精原干細(xì)胞(SSCs)生態(tài)位和BTB結(jié)構(gòu)的主要貢獻(xiàn)者，在精原細(xì)胞生態(tài)位和BTB破壞和恢復(fù)的過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，保證雄性生物體功能性睪丸的正常發(fā)育[17]。SC上還存在多種與精子發(fā)生相關(guān)的因子及其受體，例如：雄性激素(MH)、促卵泡激素(FSH)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、纖溶酶原激因子(PA)等，并促進(jìn)幾種生物活性肽生成，促進(jìn)支持精子發(fā)生和生殖細(xì)胞之間的聯(lián)系，從而支持生殖能力，參與調(diào)控精子發(fā)生過(guò)程[18-25]。本課題組在前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究中發(fā)現(xiàn)，性成熟后的蒙古馬睪丸組織中，發(fā)生可變剪切ES事件的MEI1基因在性成熟后的睪丸組織中表達(dá)量較高，且差異顯著，說(shuō)明MEI1基因的可變剪切方式可能與精子生成有關(guān)。因此，本試驗(yàn)以MEI1為目的基因，以未發(fā)生ES事件的MEI1-1為對(duì)照組，以發(fā)生ES事件的MEI1-2為試驗(yàn)組，設(shè)計(jì)構(gòu)建MEI1-1-pIRES2-EGFP和MEI1-2-pIRES2-Dsred兩種質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至蒙古馬SC，CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖及活力情況，qRT-PCR檢測(cè)減數(shù)分裂相關(guān)基因在兩類細(xì)胞中的差異表達(dá)情況。探索MEI1發(fā)生ES可變剪切事件對(duì)蒙古馬精子生成的調(diào)控作用，實(shí)現(xiàn)利用分子調(diào)控技術(shù)提高馬的精子數(shù)量和精液品質(zhì)，有效提高繁殖效率，降低生產(chǎn)成本，加快遺傳進(jìn)展，促進(jìn)種群繁衍。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1試驗(yàn)對(duì)象研究所需的支持細(xì)胞(SC)來(lái)源于兩歲蒙古馬的睪丸，細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)嚴(yán)格參照本實(shí)驗(yàn)室的操作進(jìn)行[26]。1.1.2主要儀器、試劑生物超凈臺(tái)(ESCO)、倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)、超低溫冰箱-80℃(Haier)、高壓滅菌鍋(YAMATO)、恒溫水浴鍋(YiTong)、電子天平(OHAUS)、磁力攪拌器(LIA)、純水儀(OLABO)、瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一生物科技)、臺(tái)式離心機(jī)(常州潤(rùn)華電器)、細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)；凝膠成像儀、CFX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、普通PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀均購(gòu)自Bio-Rad；酶標(biāo)儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱均購(gòu)自Thermo；不同規(guī)格的移液槍、高速冷凍離心機(jī)均購(gòu)自Eppendorf。Insulin、谷氨酰胺、DMEM/F12、NaHCO3、DMSO、G418均購(gòu)自Sigma；DPBS、FBS、0.25%Trypsin-EDTA(1×)均購(gòu)自Gibco；LipofectamineTM3000、PureLinkTMHiPurePlasmidMaxiprepKit、High-CapacitycDNAReverseTranscriptionKits均購(gòu)自Thermo；miRNeasyMiniKit(QIAGEN)、CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(biosharp)、TBGreenTMPremixEXTaqTMⅡ(TliRNaseHPlus,TaKaRa)。1.2試驗(yàn)方法1.2.1MEI1發(fā)生和未發(fā)生可變剪切事件載體的構(gòu)建命名未發(fā)生ES事件的MEI1基因?yàn)镸EI1-1，發(fā)生ES事件的MEI1基因?yàn)镸EI1-2。1.2.1.1MEI1-1-pIRES2-EGFP載體的構(gòu)建：從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取已公布的家馬(equuscaballus)MEI1基因序列(XM_023631220)，用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在空載體pIRES2-EGFP上插入長(zhǎng)度為3840bp的MEI1序列，克隆位點(diǎn)為Xhol(CTCGAG)-Smal(CCCGGG)，測(cè)序并繪制重組質(zhì)粒圖譜。1.2.1.2MEI1-2-pIRES2-Dsred載體的構(gòu)建：Premier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(引物信息見表1)。分別用MEI1-2-Xhol-F/MEI1-2up-R，MEI1-2down-F/MEI1-2-Smal-R為引物，以MEI1基因合成的MEI1-1為模板擴(kuò)增2個(gè)片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并將2個(gè)片段產(chǎn)物回收純化備用。OverlappingPCR擴(kuò)增MEI1-2基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的產(chǎn)物進(jìn)行Xhol、Smal雙酶切，并構(gòu)建到同樣酶切的pIRES2-Dsred載體上，進(jìn)行測(cè)序，繪制重組質(zhì)粒圖譜。1.2.2兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染蒙古馬支持細(xì)胞質(zhì)粒大提后酶標(biāo)儀檢測(cè)質(zhì)粒的濃度及純度，分裝并于-20℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，第三代的蒙古馬睪丸SC活性最高，因此復(fù)蘇第二代SC，傳代至大皿獲得活性及長(zhǎng)勢(shì)較好的第三代蒙古馬SC，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～90%匯合度時(shí)用LipofectamineTM3000將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于SC。在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后換液，并在轉(zhuǎn)染24、48、72h時(shí)在熒光顯微鏡下記錄轉(zhuǎn)染情況。用CCK-8試劑盒分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力及增殖，分析比較同一轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的差異性。1.2.3CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖及活性96孔板中體外培養(yǎng)第三代蒙古馬SC，待長(zhǎng)至70%～90%細(xì)胞匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒。分別再轉(zhuǎn)染0、24、48、72h時(shí)(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)平行)加入100μL新的完全培養(yǎng)液和10μLCCK-8溶液(盡量不要在孔中生成氣泡)并于恒溫培養(yǎng)箱中孵育1～4h，酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖及活性情況。1.2.4G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞構(gòu)建的兩種載體均帶有新霉素篩選標(biāo)記(G418)，便于提高轉(zhuǎn)染效率，增加后續(xù)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。預(yù)試驗(yàn)確定G418最佳篩選濃度，以便后續(xù)試驗(yàn)的連續(xù)性。在轉(zhuǎn)染效率最高、細(xì)胞活性最好時(shí)添加最佳篩選濃度的G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每3d換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)收集細(xì)胞，用于后續(xù)試驗(yàn)。1.2.5提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA經(jīng)G418篩選的轉(zhuǎn)染細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合度時(shí)進(jìn)行胰酶消化、1500r·min-1離心5min、小心棄上清收集細(xì)胞，標(biāo)注轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的名稱；miRNeasyMiniKit試劑盒提取細(xì)胞總RNA；酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA濃度及純度，并迅速將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.6qRT-PCR檢測(cè)減數(shù)分裂相關(guān)基因在細(xì)胞中的差異表達(dá)情況以轉(zhuǎn)染MEI1-1-pIRES2-EGFP的SC細(xì)胞為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染MEI1-2-pIRES2-Dsred的SC細(xì)胞為試驗(yàn)組，GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正，檢測(cè)減數(shù)分裂通路部分驗(yàn)證基因及支持細(xì)胞信號(hào)通路在精子發(fā)生減數(shù)分裂調(diào)節(jié)中的部分因子在兩種細(xì)胞中的表達(dá)量。Primerpremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表2)，并由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系：TBGreen5μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板1μL，RNase-freeddH2O3.2μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共30個(gè)循環(huán)；60℃退火7min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后整理Ct值，采用單因素方差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2結(jié)果2.1第三代蒙古馬SC培養(yǎng)復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室凍存的第二代蒙古馬SC，經(jīng)一次傳代繼續(xù)培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下觀察如圖1所示，細(xì)胞增殖速度快、長(zhǎng)勢(shì)較好、形態(tài)一致且未有老化的現(xiàn)象，符合后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的要求。圖1培養(yǎng)第3天的第3代蒙古馬SC2.2載體構(gòu)建2.2.1MEI1-1-pIRES-EGFP載體構(gòu)建結(jié)果與分析將合成的MEI1-1基因通過(guò)Xhol(CTCGAG)和Smal(CCCGGG)克隆位點(diǎn)構(gòu)建到pIRES2-EGFP空載體上。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)構(gòu)建結(jié)果如圖2所示，目的條帶與目的基因片段的長(zhǎng)度相一致，證明MEI1-1-pIRES2-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建成功。繪制MEI1-1-pIRES2-EGFP重組質(zhì)粒質(zhì)譜圖見圖3，MEI1-1基因通過(guò)Xhol和Smal克隆位點(diǎn)插入帶有綠色熒光蛋白并具有卡那抗性的pIRES2-EGFP空載體中，質(zhì)粒全長(zhǎng)9099bp，其中插入的MEI1-1基因3840bp。該載體同時(shí)具有新霉素(G418)篩選標(biāo)記，便于提高轉(zhuǎn)染效率和后續(xù)qRT-PCR的準(zhǔn)確性。1.質(zhì)粒；2.Xhol-Smal酶切質(zhì)粒；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)圖3MEI1-1-pIRES2-EGFP質(zhì)粒圖譜2.2.2MEI1-2-pIRES2-Dsred載體構(gòu)建結(jié)果與分析分別以MEI1-2-Xhol-F/MEI1-2-up-R和MEI1-2-down-F/MEI1-2-Smal-R為引物，以MEI1-1為模板擴(kuò)增2個(gè)片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4)。純化擴(kuò)增產(chǎn)物并用OverlappingPCR技術(shù)擴(kuò)增MEI1-2基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(圖5)，將產(chǎn)物2純化回收，經(jīng)雙酶切構(gòu)建到同樣酶切的空載體上。經(jīng)測(cè)序構(gòu)建重組質(zhì)粒圖譜(圖6)，質(zhì)粒全長(zhǎng)8951bp，帶有紅色熒光蛋白并具有卡那抗性和新霉素篩選標(biāo)記，便于后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的觀察分析和篩選，提高轉(zhuǎn)染效率，減少qRT-PCR的誤差，保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。Up.以MEI1-2-Xhol-F/MEI1-2-up-R為引物擴(kuò)增的產(chǎn)物；down.以MEI1-2-down-F/MEI1-2-Smal-R為引物擴(kuò)增的產(chǎn)物M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.分別為不同融合的1個(gè)PCR產(chǎn)物圖6MEI1-2-pIRES2-Dsred質(zhì)粒圖譜2.3兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染蒙古馬SC構(gòu)建的兩種質(zhì)粒分別在轉(zhuǎn)染SC24、48、72h時(shí)觀察轉(zhuǎn)染效率。比較發(fā)現(xiàn)，兩種質(zhì)粒均在轉(zhuǎn)染48h時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高(圖7、圖8)。A.暗場(chǎng)像；B.明場(chǎng)像A.暗場(chǎng)像；B.明場(chǎng)像2.4CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖及活性根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)用XLSX工作表作圖(圖9)顯示，轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染0～72h之間細(xì)胞增殖及活力狀況呈“S”形趨勢(shì)，均先下降再上升再下降，其中在轉(zhuǎn)染0～24h曲線下降，但轉(zhuǎn)染MEI1-1-pIRES-EGFP質(zhì)粒的細(xì)胞活性高于轉(zhuǎn)染MEI1-2-pIRES2-Dsred質(zhì)粒的細(xì)胞；在轉(zhuǎn)染24～72h曲線先上升后下降，且轉(zhuǎn)染MEI1-2-pIRES2-Dsred質(zhì)粒細(xì)胞的活性較轉(zhuǎn)染MEI1-1-pIRES-EGFP質(zhì)粒的細(xì)胞的活性增長(zhǎng)速度快，并在48h時(shí)兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞活性最高，可用于轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的篩選。圖9CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖及活性折線圖2.5G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h時(shí)添加預(yù)試驗(yàn)摸索的G418最佳篩選濃度(350μg·mL-1)，每3d更換一次新的完全培養(yǎng)液直至細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合度時(shí)熒光顯微鏡拍照觀察(圖10、圖11)篩選結(jié)果并收集細(xì)胞。由圖可知，經(jīng)G418篩選的兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率均明顯提高，有利于減小后續(xù)qRT-PCR的誤差。A.暗場(chǎng)像；B.明場(chǎng)像A.暗場(chǎng)像；B.明場(chǎng)像2.6qRT-PCR檢測(cè)利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)qRT-PCR過(guò)程，以F=2-ΔΔCt為運(yùn)算公式并用SPSS進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，并用Graphpad作圖。如圖12所示，目的基因在兩種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量均差異顯著，且在MEI1-2-pIRES2-Dsred轉(zhuǎn)染的SC細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量均高于MEI1-1-pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染SC細(xì)胞的表達(dá)量。證明發(fā)生ES事件的MEI1在SC中的表達(dá)量高于未發(fā)生ES事件的MEI1表達(dá)量，且經(jīng)SC更有利于調(diào)控減數(shù)分裂和精子發(fā)生過(guò)程，影響精子生成。A、B、C.減數(shù)分裂通路部分驗(yàn)證基因檢測(cè)結(jié)果；D.支持細(xì)胞信號(hào)通路中調(diào)節(jié)精子發(fā)生減數(shù)分裂的部分因子檢測(cè)結(jié)果3討論隨著測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的研究表明正常的可變剪切事件可以豐富基因組和蛋白質(zhì)組的多樣性、調(diào)控生物體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，異常的可變剪切事件可能會(huì)引發(fā)生物體疾病[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，SALL4可變剪切體調(diào)控?fù)p傷會(huì)導(dǎo)致心和腎發(fā)育缺陷，還可能會(huì)引起中國(guó)女性卵巢發(fā)育不成熟[28]；WT1突變體缺陷(-KTS)會(huì)影響生殖嵴細(xì)胞的增殖，增加性腺前部區(qū)域的凋亡細(xì)胞數(shù)量，影響原始生殖細(xì)胞的增殖[29-30]；特異性敲除生殖細(xì)胞中Ranbp9后會(huì)導(dǎo)致精母細(xì)胞和精細(xì)胞大量缺失[31]；Rbm5缺失會(huì)導(dǎo)致大量功能性基因的pre-mRNA剪接發(fā)生異常，影響雄性動(dòng)物生育功能[32]；特異性敲除雄性生殖細(xì)胞中的PTBP2會(huì)造成精母細(xì)胞的大量凋亡和精細(xì)胞分化的停滯，并且伴隨生殖細(xì)胞mRNA的可變剪接嚴(yán)重異常，影響雄性生殖細(xì)胞的存活等[33]。由此可見，可變剪接以其獨(dú)特的調(diào)控方式廣泛參與精子生成過(guò)程，為雄性生殖細(xì)胞的健康發(fā)育提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。MEI1是已發(fā)現(xiàn)的正常減數(shù)分裂染色體突觸中的必需基因，并可能參與生殖細(xì)胞減數(shù)分裂DSBs的形成過(guò)程。我們?cè)谇捌谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)生可變剪切ES事件的MEI1基因在性成熟后的睪丸組織中表達(dá)量較高，且差異顯著，說(shuō)明MEI1基因的可變剪切方式可能與精子生成有關(guān)。而睪丸SC作為唯一一種可以直接接觸不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞的體細(xì)胞，不僅參與形成BTB，為精子發(fā)生提供穩(wěn)定的微環(huán)境，還分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)精子的發(fā)生。因此，本試驗(yàn)以蒙古馬SC為目的細(xì)胞，探索MEI1發(fā)生和不發(fā)生ES事件對(duì)精子生成的影響。結(jié)果表明，在細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果中，轉(zhuǎn)染發(fā)生可變剪切事件的MEI1過(guò)表達(dá)載體的SC生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)染未發(fā)生可變剪切的SC。說(shuō)明MEI1基因可變剪切確實(shí)有效促進(jìn)了支持細(xì)胞生長(zhǎng)，從而促進(jìn)成熟精子生成。減數(shù)分裂發(fā)生期間非同源染色體自由組合、同源染色體非姐妹染色單體間部分片段發(fā)生交叉互換(基因重組)增加了基因變異種類和配子的遺傳多樣性，有利于物種適應(yīng)不斷發(fā)生變化的環(huán)境，保證物種的延續(xù)[34]。為了研究睪丸SC細(xì)胞與精子發(fā)生過(guò)程的關(guān)系，選取部分減數(shù)分裂通路上的關(guān)鍵基因，檢測(cè)其在兩類細(xì)胞中的差異表達(dá)情況。其中，PPP2R5C突變會(huì)影響細(xì)胞增殖、加速細(xì)胞凋亡速度并可能導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞[35-36]；下調(diào)SKP1會(huì)提高早期胚胎染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目變異幾率，促進(jìn)胚胎早期發(fā)育的同時(shí)增加了早期胚胎的死亡率[37]；CUL1與SKP1共同介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解過(guò)程，調(diào)控細(xì)胞周期和早期胚胎發(fā)育過(guò)程[38-39