發(fā)酵期發(fā)酵的發(fā)酵發(fā)酵的病原學(xué)鑒定及藥劑篩選

發(fā)酵期發(fā)酵的發(fā)酵發(fā)酵的病原學(xué)鑒定及藥劑篩選

芋頭主要種植在熱帶地區(qū)，是東南亞和太平洋地區(qū)的重要作物。芋頭的種植量在食根作物中位于馬鈴薯、木薯、甘薯和山藥之后，位列第五。據(jù)國際糧農(nóng)組織2011年報(bào)告，2009年世界芋頭產(chǎn)量1100萬t，中國的產(chǎn)量位列第二。2008年中國芋頭出口位列第一，每年4.9萬t。依食用部位不同，分為葉用變種及球莖變種。球莖變種主要分為2種類型：魁芋類和多子芋類（Irwin,1998）。芋頭疫病由卵菌門的芋疫霉菌Racib.侵染所致。疫病是芋頭生產(chǎn)過程中的一種主要限制因素,可引起芋頭減產(chǎn)25%～30%(Thankappan,1985)。國外已有收集芋頭品種,并鑒定其疫病抗性的報(bào)道(Brooks,2008)。已從芋頭品種中鑒定出9種抗疫病的基因(Sharma,2008)。用AFLP(Sharma,2008)對印度芋頭品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析,并找到了與疫霉病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記。國內(nèi)對芋頭的研究較少,只有用RAPD對芋頭的多樣性進(jìn)行了研究(龍雯虹,2001),至今還未見芋頭品種抗疫病的報(bào)道。本文收集從廣東、廣西、湖南和湖北等主要芋頭產(chǎn)區(qū)收集芋頭品種,并用離體葉片法進(jìn)行了疫病的抗病性鑒定。并選擇感病品種在大田進(jìn)行了防治芋頭疫病的藥劑篩選。這些研究對我國芋頭的生產(chǎn)具有重要的意義。1材料和方法1.1不同類型的芋頭產(chǎn)品從廣東、廣西、湖南和湖北等主要芋頭產(chǎn)區(qū)收集芋頭品種和野生種，種植于實(shí)驗(yàn)田中。1.2真菌培養(yǎng)和pcr擴(kuò)增芋頭疫霉菌的分離參考李智軍等的方法。從辣椒發(fā)病田塊采集具有芋頭疫病典型癥狀的病葉，切取病健交接部位2～3小塊，置于含抗生素胡蘿卜培養(yǎng)基（CA）平板（青霉素50mg、利福平100mg、胡蘿卜200g榨汁、瓊脂20g/L）上，25℃～28℃培養(yǎng)2d后，挑取菌落邊緣菌絲少許，轉(zhuǎn)接至不含任何藥劑的CA培養(yǎng)基上在同樣溫度條件下培養(yǎng)3d～5d。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察為疫霉菌。保存菌種作抗病性鑒定（李智軍，2007）。用MightyAmpDNA聚合酶來擴(kuò)增真菌ITS。用引物ITS和ITS4來擴(kuò)增真菌的ITS。ITS4和ITS5分別為TCCTCCGCTTATTGATATGC和GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG[O′DONNEL-L,1997]。用60l的反應(yīng)體系，按如下組成配制：25.5l滅菌雙蒸水，30l2×MightyAmp緩沖液，1.5lMightyAmpDNA聚合酶，3.0l引物混合液（按等體積混合10mol/LITS4和ITS5前導(dǎo)引物和隨后引物）。用牙簽挑菌落到PCR混合液中。PCR的條件如下：98℃2min,98℃10s,55℃15s,68℃1min,40個(gè)循環(huán)。取5l點(diǎn)樣，取剩余的擴(kuò)增陽性的反應(yīng)液送公司測序。1.3點(diǎn)樣和培養(yǎng)方用塑料袋取第2或第3嫩的葉片到室內(nèi)，于搪瓷盤放2層沙布，加適量的滅菌水，將葉片平鋪于搪瓷盤中，在葉片選4個(gè)點(diǎn)，其中3個(gè)點(diǎn)各點(diǎn)20l每升106個(gè)分生孢子液的孢子懸液，另一個(gè)點(diǎn)點(diǎn)20l滅菌水作對照。點(diǎn)樣后小心用塑料薄膜蓋住搪瓷盤保濕。于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4d后測量病斑的直徑（Brooks,2008）。1.4藥劑、藥劑防治選用感病的湛江-8芋頭品種作材料，種植于大田，芋疫病零星發(fā)病時(shí)開始進(jìn)行藥劑防治。所選藥劑均為對疫霉菌有效的農(nóng)藥。按照藥劑使用說明確定稀釋倍數(shù)和用藥量，葉片正反面均勻噴霧，噴霧過程中用塑料膜將不同處理間隔。4月24日第1次用藥，經(jīng)檢查；5月2日第2次用藥；5月9日第3次用藥。試驗(yàn)期間除施用殺蟲劑外未施用其他殺菌劑，水肥等田間管理按常規(guī)管理。1.4.2鹽蝦確立病斑病斑面積調(diào)查在施藥前1d（即6月5日）調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算藥前病情指數(shù)，第3次噴藥后7d（即5月16日）調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。每小區(qū)隨機(jī)調(diào)查3個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)5株，共查15株，自上而下調(diào)查全部葉片的發(fā)病情況，根據(jù)病害分級，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。a）芋疫病分級標(biāo)準(zhǔn)：0級為無病斑；1級為病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級為病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；5級為病斑面積占整個(gè)葉面積11%～25%；7級為病斑面積占整個(gè)葉面積26%～50%；9級為病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。b）病情指數(shù)和防治效果按下面公式計(jì)算：病情指數(shù)式中：——對照區(qū)施藥前病情指數(shù)——空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)2結(jié)果與分析2.1菌株間的抗性鑒定結(jié)果在CA培養(yǎng)基上，菌落均勻，氣生菌絲較少，邊緣明顯，生長較慢。菌絲形態(tài)簡單，較細(xì)，粗2m～7m；孢囊梗不規(guī)則分枝、傘形分枝或合軸分枝，直徑2.0m～4.0m。孢子囊卵形、長卵形、橢圓形，基部圓形，頂部有一乳頭狀突起（圖1）。用ITS引物從所有的所分離的真菌中擴(kuò)增出900bp左右的產(chǎn)物，測序后用Blast進(jìn)行同源性分析，與NCBI(NationalCentreofBioinformation）中JN661147.1(Phytophthoracolocasiae）具有97%的一致性，因此所分離的真菌為芋頭疫霉菌。離體葉片抗性鑒定結(jié)果，其中有5個(gè)芋頭品種接種后病癥為水浸狀，無法測定病斑直徑。這些材料在接種6d后，葉片腐爛，因此認(rèn)為這些為感病品系。其余39個(gè)品系經(jīng)接種鑒定后形成明顯的病斑，測定病斑的直徑后，經(jīng)方差分析，F(xiàn)值為41.26，都比F0.05=1.54顯著大，說明各品系間抗病性差異顯著。芋頭品系的抗性按下列標(biāo)準(zhǔn)劃分：病斑直徑小于0.5cm為抗??；0.5cm～1.0cm為中抗；大于1.0cm為感病。在這些品系中，抗病品系只有8個(gè)，分別為惠州-1、惠州-2、廉江-1、湛江-5、湛江-10、韶關(guān)-1、韶關(guān)-2和武漢-1，占18.2；中抗11個(gè)，分別為佛山-2、廣州-2、江門-1、茂名-2、汕頭-3、湛江-7、湛江-9、北海-1、興安-2、荊州-1和浠水-1，占25.0%；感病品系20個(gè)，加上前面接種后癥狀為水浸狀的2個(gè)芋頭品系，占56.8%（見表1）。2.3種農(nóng)藥對饅頭病害的防治效果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，施藥后病指的F值為63.8，大于F0.05=2.85。各處理間差異顯著。上述6種農(nóng)藥對芋頭疫病的防治效果如表2。從表中看出施用農(nóng)藥的幾個(gè)處理與對照相比均具有顯著的防效。只是不同藥劑對疫病的防效也具有顯著的差異，其中錳鋅.氟嗎啉、50%烯酰嗎啉和霜脲.錳鋅的防效在60%以上，可用于芋頭疫病的防治。3治療巖菌病的品種及防治手段真菌的分子鑒定需要許多煩瑣的步驟，包括DNA的提取，有許多報(bào)道有關(guān)從細(xì)菌和真菌中提取DNA方法的報(bào)道（LIGOZZI,2003;MELO2006）。本文用一種對酶抑制物不敏感的MightyAmpDNA聚合酶對疫霉菌進(jìn)行菌落PCR，該方法不需要對真菌進(jìn)行任何處理，且只需要一點(diǎn)樣品即可，因此可降低在DNA提取過程中污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也更為快捷。我國芋頭主產(chǎn)區(qū)珠江流域、長江及淮河流域，有大量的芋頭品種（Zhang,1984）。許多農(nóng)戶不知道所種植的芋頭品種的名稱，這給芋頭品種的收集、抗病性鑒定及種質(zhì)資源的保存造成了相當(dāng)大的麻煩。國外在建立芋頭的核心種質(zhì)資源庫時(shí)，使用顯性的穩(wěn)定的農(nóng)業(yè)性狀可對芋頭品系進(jìn)行初步分類。本文也采用形態(tài)學(xué)對所收集的品系進(jìn)行了初步篩選，然后再進(jìn)行抗病性鑒定。采用2種抗病性鑒定指標(biāo)，侵染頻率和（Birhman,1995），病斑直徑（Iwaro,1997），認(rèn)為離體葉片接種法是一種簡潔快速鑒定芋頭疫病抗病性的方法，接種后5d的病斑平均直徑是鑒定疫霉菌的有效指標(biāo)（Brooks,2008）。本文采用離體葉片鑒定法對芋頭品系進(jìn)行了抗病性鑒定，各品系間抗病性差異顯著，所篩選的抗病品系可用生產(chǎn)中防治疫病的為害。藥劑試驗(yàn)結(jié)果表明，錳鋅·氟嗎啉、50%烯酰嗎啉和霜脲·錳鋅對芋頭疫病有明顯地控制作用，防治效果較好，可用于疫病的防治中。這個(gè)結(jié)論與50%烯酰嗎啉防治芋頭疫病的效果好一致（朱敦軍，2009）。在生產(chǎn)實(shí)踐中，芋頭疫