辨體調(diào)理膏制劑工藝的優(yōu)化

辨體調(diào)理膏制劑工藝的優(yōu)化

冬季用藥已成為人們恢復(fù)和調(diào)節(jié)身體、糾正健康狀況的最受歡迎的方法之一。辨體調(diào)理膏是我院使用人數(shù)最多的膏方,是由多位名老中醫(yī)研究得出的用于冬令滋補(bǔ)調(diào)理的代表方劑。全方由銀杏200g,山藥120g,薏苡仁200g,山楂250g,陳皮120g,紅棗120g,核桃200g,芝麻200g,龜甲膠250g,阿膠250g,冰糖250g組成,藥味少而經(jīng)典,主治勞倦內(nèi)傷、氣弱血虛、陽(yáng)浮外越,并且它也是組成各類膏方的基礎(chǔ)方藥,臨床應(yīng)用十分廣泛。目前,辨體調(diào)理膏是按傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)制備,各批次膏方會(huì)有一定的質(zhì)量差異,也可能導(dǎo)致臨床療效的不同,因此,對(duì)其制劑工藝的研究十分必要。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道膏方的制劑研究很少,還沒(méi)有形成一套嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的工藝流程,本研究將對(duì)膏方制備過(guò)程中的幾個(gè)重要環(huán)節(jié),包括藥材煎煮條件、煎煮容器、膠類藥?kù)然冗M(jìn)行研究,以確定辨體調(diào)理膏的最佳工藝條件,從而保證有效成分含量的穩(wěn)定性和膏方質(zhì)量的可靠性,達(dá)到安全、有效用藥的目的。1儀器、試劑和儀器Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)(AgilentTechnologies,USA),配四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、紫外檢測(cè)器、ChemStation工作站控制系統(tǒng);TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司,中國(guó));METTLERAE240電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司,中國(guó));MinispanPlus臺(tái)式高速離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司,中國(guó));MILI-Q超純水系統(tǒng)(Millipore,USA);KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,中國(guó))等。標(biāo)準(zhǔn)品橙皮苷(純度≥99.0%)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;明膠(BC)、硫酸銅(AR)、四水合酒石酸鉀鈉(AR)均購(gòu)自上海晶純?cè)噭┯邢薰?氫氧化鈉(AR)購(gòu)于杭州蕭山化學(xué)試劑廠;乙腈(特級(jí)色譜純)和甲醇(一級(jí)色譜純)購(gòu)于天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司;甲酸(AR)購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;辨體調(diào)理膏及其原料藥材由本院中藥房提供。2方法和結(jié)果2.1a/vv/v乙腈+乙腈b相AglientZORBAXSB-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5.0μm);流動(dòng)相:水相D相為0.05%甲酸-水(V/V),有機(jī)相B相為乙腈,梯度洗脫,0～7min,8%～15%B,7～16min,15%～20%B,16～20min,20%～24%B,20～24min,24%～24%B,24～30min,24%～85%B,30～35min,85%～95%B,流速為0.8mL/min;進(jìn)樣量為20μL;柱溫為25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。2.2水合酒石酸鉀鈉knac4h4h3.4h2o的制備稱取硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.75g、四水合酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)3.0g溶于250mL水中,在攪拌條件在下加入10%NaOH溶液150mL,用水稀釋至500mL,即得。2.3對(duì)照品溶液配制精密稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品4.60mg,用甲醇溶解,并定容于10mL容量瓶中,配制成濃度為0.46mg/mL儲(chǔ)備液,于4℃避光保存。分別精密吸取儲(chǔ)備液適量,并稀釋成系列濃度的對(duì)照品溶液,供分析用。精密稱取明膠1.07g,用純水溶解,超聲15min,并定容于50mL量瓶中,配制成21.40mg/mL儲(chǔ)備液,于4℃避光保存。供分析用。2.4制備最佳規(guī)劃劑稱取辨體調(diào)理膏組方藥材銀杏40g,山藥24g,米仁40g,山楂50g,陳皮24g,紅棗24g,用水浸泡20min,采用3因素3水平L9(34)正交實(shí)驗(yàn)法,因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1,考察膏方藥材的煎煮條件。在同一煎煮條件下,采用砂鍋、陶瓷鍋、不銹鋼鍋、考察膏方藥材的煎煮容器。每組樣品濃縮至800mL,真空包裝成4小包,4℃冰箱中保存,供分析用。精密吸取上述過(guò)程制備的樣品各2.5mL,用水稀釋,搖勻,并定容至5.0mL,用0.45μm濾膜過(guò)濾,濾液作為供試品溶液。精密稱取阿膠5.0g,分別采用水加熱烊膠、黃酒加熱烊膠、水溶微波烊膠3種方法進(jìn)行烊膠,水和黃酒各加10.0mL,得到烊膠后的樣品溶液。精密吸取樣品溶液0.2mL,稀釋50倍,取1.0mL,加雙縮尿試劑4.0mL,混勻,常溫下顯色30min,554nm處檢測(cè),考察不同烊膠方法所致的阿膠蛋白質(zhì)含量差異。精密稱取龜甲膠8.0g,水和黃酒各加16.0mL,龜甲膠烊膠方式考察方法同阿膠。2.5方法的精密度、準(zhǔn)確度和回收率采用優(yōu)化后的液相色譜條件,進(jìn)樣分析一系列濃度(4.60×10-3～4.60×102μg/mL)的橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程y=38729x+59.711,相關(guān)系數(shù)R2=0.9995,線性良好。測(cè)定信噪比為3時(shí)的進(jìn)樣濃度即檢測(cè)限(LOD),LOD為1.42×10-3μg/mL,測(cè)定信噪比為10時(shí)的進(jìn)樣濃度即定量限(LOQ),LOQ為4.60×10-3μg/mL,方法靈敏度高。配制濃度為72.00μg/mL橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液6份,同一天內(nèi)進(jìn)樣分析,計(jì)算日內(nèi)精密度,RSD為2.41%,連續(xù)6日每日進(jìn)樣分析,計(jì)算日間精密度,RSD為4.06%,精密度良好。按供試品溶液制備方法,制備6份供試品溶液進(jìn)樣分析,以橙皮苷的濃度計(jì)算其RSD,來(lái)評(píng)估方法的重復(fù)性,RSD為3.60%;按供試品溶液制備方法,分別于0、2、6、12、24h進(jìn)樣分析,以橙皮苷濃度計(jì)算其RSD,結(jié)果為1.41%;按加樣回收率測(cè)定方法,分別在已知含量的樣品中,加入中濃度的橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按照供試品溶液制備方法制備供試品6份,進(jìn)樣分析,計(jì)算加樣回收率,RSD為3.72%,回收率為95.85%;以上結(jié)果證明該分析方法重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度好。本法可適用于辨體調(diào)理膏制劑過(guò)程分析。2.6外標(biāo)法進(jìn)行的檢測(cè)膏方藥材煎煮條件的篩選采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行,9組實(shí)驗(yàn)液相分析結(jié)果見(jiàn)圖1所示,并采用外標(biāo)法測(cè)定了主要有效成分橙皮苷的含量,以橙皮苷含量為指標(biāo),進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表2。2.7液相分析結(jié)果選取目前常用的煎膏容器砂鍋、陶瓷鍋、不銹鋼鍋,在同一煎煮條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),液相分析結(jié)果見(jiàn)圖2所示,外標(biāo)法測(cè)定3組樣品中橙皮苷的含量,結(jié)果為C砂鍋=175.48μg/mL,C陶瓷鍋=115.69μg/mL,C不銹鋼鍋=41.47μg/mL。2.8種中小型膠的蛋白質(zhì)含量采用水加熱烊膠、黃酒加熱烊膠、水溶微波烊膠3種方法分別烊化阿膠和龜甲膠,以明膠為對(duì)照品,紫外分光光譜法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量,考察這3種烊膠方法對(duì)阿膠和龜甲膠中蛋白質(zhì)含量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3所示。3討論3.1流動(dòng)相梯度優(yōu)化色譜條件優(yōu)化過(guò)程中,對(duì)流動(dòng)相溶劑(甲醇、乙腈)、流動(dòng)相梯度、流動(dòng)相酸度(0.01%、0.025%、0.05%、0.075%甲酸)、流速(0.8、1.0、1.2mL/min)進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),乙腈對(duì)化合物的洗脫能力強(qiáng)于甲醇,使得分析時(shí)間明顯縮短,而且對(duì)橙皮苷的分離效果也比較好;在流動(dòng)相梯度優(yōu)化過(guò)程中采用了梯度洗脫的模式,并且在橙皮苷出峰前的一小段時(shí)間內(nèi)采用有機(jī)相(B)比例為24%,水相(D)比例為76%的等度洗脫,使得橙皮苷色譜峰與其相鄰色譜峰(柚皮苷)達(dá)到基線分離(見(jiàn)圖4),充分保證了橙皮苷含量測(cè)定的準(zhǔn)確性;隨著流動(dòng)相酸度增大,橙皮苷色譜峰的峰形得到改善,但是考慮到過(guò)高的酸度可能對(duì)色譜柱的使用壽命產(chǎn)生影響,所以選擇甲酸的濃度為0.05%。3.2不同制備工藝對(duì)藥材質(zhì)量的影響從圖1中可以看出,隨著藥材煎煮次數(shù)的增多,藥材有效成分的煎出率顯著提高,煎煮3次可使各種藥材的有效成分充分提取出來(lái),但是發(fā)現(xiàn)并不是煎煮時(shí)間越長(zhǎng),有效成分含量越高,因?yàn)橛行┏煞挚赡茈S著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)而分解,橙皮苷就是這類成分,表1中橙皮苷含量測(cè)定結(jié)果也證實(shí)了這一現(xiàn)象,以橙皮苷含量為指標(biāo)的方差分析結(jié)果表明,煎煮時(shí)間對(duì)橙皮苷含量有顯著性影響,而加水量和煎煮次數(shù)無(wú)顯著性影響,此外,從圖1中并不能發(fā)現(xiàn)加水量對(duì)藥材煎出率的明顯改變。考慮到煎煮次數(shù)的增加可使各類藥材的有效成分充分提取出來(lái),并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際,最終將藥材煎煮條件確定為:煎煮時(shí)間30min,加水量8倍,煎煮次數(shù)3次。在該條件下進(jìn)行辨體調(diào)理膏制劑的生產(chǎn),既保證了膏方藥材有效成分的煎出率,又能減少損失提高效率。3.3外標(biāo)法測(cè)定橙皮苷的含量從圖2中發(fā)現(xiàn),使用砂鍋煎煮膏方,可使膏方藥材有效成分的煎出率顯著提高,且明顯高于陶瓷鍋和不銹鋼鍋,外標(biāo)法測(cè)定橙皮苷的含量結(jié)果顯示,使用砂鍋?zhàn)鳛榧甯嗳萜魉玫某绕ぼ蘸渴鞘褂貌讳P鋼鍋為煎膏容器所得的橙皮苷含量的4倍,陶瓷鍋也比不銹鋼鍋高出2倍,因此民間常用砂鍋或陶瓷鍋煎煮膏方,但現(xiàn)在也有不少病人出于便利采用不銹鋼鍋煎煮膏方,勢(shì)必影響藥材有效成分的含量,不能達(dá)到最佳的治療目的,故建議病人采用砂鍋煎煮膏方藥材。3.4微波加熱實(shí)驗(yàn)圖3顯示了不同烊膠方法對(duì)阿膠和龜甲膠中蛋白質(zhì)含量的影響,黃酒加熱烊膠所得到的蛋白質(zhì)最多,水加熱烊膠次之,而水溶微波烊膠得到的蛋白質(zhì)最少,且明顯少于前兩者,可能是由于微波引起部分蛋白質(zhì)的降解。雖然有不少病人出于便捷而使用微波爐來(lái)烊化阿膠等膠類藥