復(fù)旦藥學(xué)院2007級課件生物化學(xué)核酸

核酸的化學(xué)什么是核酸核酸(nucleicacid)：以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。天然核酸分為兩大類：DNA（Deoxyribonucleicacid)脫氧核糖核酸RNA（Ribonucleicacid)

核糖核酸1868年FridrichMiescher從膿細(xì)胞中提取“核素”1944年

Avery等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)1953年

Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)1968年Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼1975年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶1981年Gilbert和Sanger建立DNA測序方法1985年Mullis發(fā)明PCR技術(shù)1990年美國啟動人類基因組計(jì)劃(HGP)

1994年中國人類基因組計(jì)劃啟動2001年美、英等國完成人類基因組計(jì)劃基本框架核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進(jìn)展核酸的分類及分布、功能脫氧核糖核酸

核糖核酸90%以上分布于細(xì)胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質(zhì)粒等。分布于胞核、胞液。攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個(gè)體的基因型(genotype)。參與細(xì)胞內(nèi)DNA遺傳信息的表達(dá)。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。第一節(jié)核酸的組成與結(jié)構(gòu)一、元素組成主要元素組成：C、H、O、N、P(9~11%)與蛋白質(zhì)比較，核酸一般不含S，而P的含量較為穩(wěn)定，占9-11%。二、基本構(gòu)成單位：核苷酸(nucleotide)核苷酸由戊糖、磷酸和含氮堿三部分構(gòu)成戊糖（構(gòu)成RNA）1′2′3′4′5′核糖(ribose)（構(gòu)成DNA）脫氧核糖(deoxyribose)嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)堿基嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)堿基的結(jié)構(gòu)特征

嘌呤堿和嘧啶堿分子中都含有共軛雙鍵體系，在紫外區(qū)有吸收（260nm左右）。核苷nucleoside堿基和核糖（脫氧核糖）通過糖苷鍵連接形成核苷（脫氧核苷）。

1′1核糖核苷：AR,GR,UR,CR脫氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

核苷酸(ribonucleotide)核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。

2、稀有核苷酸：稀有堿基/核苷/核苷酸3、核苷酸的其他形式多磷酸核苷（NDP、NTP)環(huán)化核苷酸（cAMP、cGMP等）輔酶或輔基（NAD、NADP、FAD、CoA等，均含有AMP），活性代謝物（UDPG、CDP-膽堿，等）

1、核苷酸的組成：含氮堿基、戊糖和磷酸。summaryATP分子的最顯著特點(diǎn)是含有兩個(gè)高能磷酸鍵。ATP水解時(shí),可以釋放出大量自由能。ATP是生物體內(nèi)最重要的能量轉(zhuǎn)換中間體。ATP水解釋放出來的能量用于推動生物體內(nèi)各種需能的生化反應(yīng)。ATP也是一種很好的磷?；瘎?。磷酰化反應(yīng)的底物可以是普通的有機(jī)分子，也可以是酶。磷?；牡孜锓肿泳哂休^高的能量（活化分子），是許多生物化學(xué)反應(yīng)的激活步驟。環(huán)化核苷酸:cAMP，cGMPcAMP主要功能是作為細(xì)胞的第二信使。核苷酸在生物體內(nèi)有許多重要的生理生化作用：作為RNA和DNA合成的前體物質(zhì)；作為代謝的調(diào)節(jié)物質(zhì),活化代謝中間產(chǎn)物；作為輔酶的成份；參與信息傳遞；作為甲基供體，參與體內(nèi)甲基化反應(yīng)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，強(qiáng)化胃腸道功能，抗氧化等等5′端3′端

核苷酸的連接

以磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。CGA三、核酸的分子結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)（一）一級結(jié)構(gòu)

一級結(jié)構(gòu)（primarystructure）是指核酸分子中核苷酸的排列順序及連接方式。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。1、核苷酸的連接方式：3

,5

磷酸二酯鍵2、核酸的基本結(jié)構(gòu)形式：多核苷酸鏈信息量：4n末端：5

端、3

端多核苷酸鏈的方向：5’端→3’端(由左至右)3、表示方法：結(jié)構(gòu)式、線條式、文字縮寫5′端3′端CGA磷酸二酯鍵書寫方法AGP5

PTPGPCPTPOH3

5

pApCpTpGpCpT-OH

3

5

ACTGCT

3

（二）空間結(jié)構(gòu)DNA的空間結(jié)構(gòu)1、DNA的二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）

——雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景堿基組成分析—Chargaff規(guī)則：[A]=

[T]；[G]

[C]堿基的理化數(shù)據(jù)分析：A-T、G-C以氫鍵配對較合理DNA纖維的X-線衍射圖譜分析DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)

doublehelixmodelDNA分子由兩條相互平行但走向相反的脫氧多核苷酸鏈組成，兩鏈以-脫氧核糖-磷酸-為骨架，以右手螺旋方式繞同一公共軸盤。螺旋直徑為2nm，形成大溝(majorgroove)及小溝(minorgroove)相間。嘌呤和嘧啶堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。堿基環(huán)平面與螺旋軸垂直，糖基環(huán)平面與堿基環(huán)平面成90°角。螺旋橫截面的直徑約為2nm，每條鏈相鄰兩個(gè)堿基平面之間的距離為0.34nm，每10個(gè)核苷酸形成一個(gè)螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈的高度）為3.4nm。維持兩條DNA鏈相互結(jié)合的力是鏈間堿基對形成的氫鍵。堿基結(jié)合具有嚴(yán)格的配對規(guī)律:A與T結(jié)合，G與C結(jié)合，這種配對關(guān)系，稱為堿基互補(bǔ)。A和T之間形成兩個(gè)氫鍵，G與C之間形成三個(gè)氫鍵。在DNA分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。螺旋表面形成大溝(majorgroove)及小溝(minorgroove)，彼此相間排列。小溝較淺；大溝較深，是蛋白質(zhì)識別DNA堿基序列的基礎(chǔ)。DNA雙螺旋的穩(wěn)定性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)在生理?xiàng)l件下很穩(wěn)定。氫鍵維持雙鏈橫向穩(wěn)定性，堿基堆積力維持雙鏈縱向穩(wěn)定性。雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成的疏水區(qū)，消除了介質(zhì)中水分子對堿基之間氫鍵的影響；介質(zhì)中的陽離子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，降低了DNA鏈之間的排斥力等。改變介質(zhì)條件和環(huán)境溫度，將影響雙螺旋的穩(wěn)定性。

B-DNA(Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)模型)Z-DNA（左手雙螺旋）

A-DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性1979年發(fā)現(xiàn)：螺距延長(4.5nm左右)，直徑變窄(1.8nm)，每個(gè)螺旋含12個(gè)堿基對，分子鏈中磷原子鋸齒形排列。重復(fù)單位是二核苷酸。只有一個(gè)螺旋溝，相當(dāng)于B構(gòu)象中的小溝，大溝則不復(fù)存在。生物學(xué)意義：與致癌、突變、基因調(diào)節(jié)有關(guān)

三鏈DNA結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體重組以及DNA復(fù)制有關(guān)，但作用機(jī)制不詳。

天然存在的DNA分子最顯著的特點(diǎn)是很長，分子質(zhì)量很大，一般在106～1010。2、DNA的三級結(jié)構(gòu)——超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)：DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同負(fù)超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反or3、DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝核小體(nucleosome)：

由DNA和組蛋白構(gòu)成。DNA：以負(fù)超螺旋纏繞在組蛋白上組蛋白核心：H2B,H2A,H3,H4H1組蛋白在核小體之間DNA的存在形式核小體的折疊及染色體的組裝4、DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動的信息基礎(chǔ)?；驈慕Y(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。一個(gè)生物體的全部基因序列稱為基因組。RNA的分子結(jié)構(gòu)RNA的種類、分布、功能miRNA與siRNAmiRNA，是一種19-25nt長的單鏈小分子RNA。它廣泛存在于真核生物中，由基因編碼，從DNA轉(zhuǎn)錄而來，但不翻譯成蛋白。成熟的miRNA分子主要功能是下調(diào)基因的表達(dá)。siRNA，SmallinterferingRNA：是一種小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAaseⅢ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。siRNA是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默。miRNA與siRNA的作用機(jī)制miRNA與siRNA相同點(diǎn)：1．miRNA和siRNA都是由22個(gè)左右的核苷組成；

2．都是Dicer酶的產(chǎn)物；

3．在起干擾、調(diào)節(jié)作用時(shí)都會和RISC復(fù)合體結(jié)合；

4．都可以在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平干擾以抑制靶標(biāo)基因的翻譯；不同點(diǎn)：1．miRNA通常是內(nèi)源性的，siRNA通常是外源性的；

2．二者產(chǎn)生方式不同，參與切割的Dicer酶的亞類不同；

3．組成RISC復(fù)合體的蛋白不同；

4．作用目的不同，miRNA常參與調(diào)節(jié)與生長發(fā)育有關(guān)的基因，siRNA通常用于沉默外源病毒等RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)RNA是單鏈分子，因此在RNA分子中，嘌呤的總數(shù)不一定等于嘧啶的總數(shù)。RNA分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，不能形成雙螺旋的部分，則形成單鏈突環(huán)。這種結(jié)構(gòu)稱為“發(fā)夾型”結(jié)構(gòu)。在RNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基的配對情況不象DNA中嚴(yán)格。不同類型的RNA,其二級結(jié)構(gòu)有明顯的差異。tRNA中除了常見的堿基外，還存在一些稀有堿基，這類堿基大部分位于突環(huán)部分.1、信使RNA的結(jié)構(gòu)與功能*真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.大多數(shù)真核mRNA的5′末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一個(gè)7-甲基鳥苷，同時(shí)第一個(gè)核苷酸的C′2也是甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-2.大多數(shù)真核mRNA的3′末端有一個(gè)多聚腺苷酸(polyA)結(jié)構(gòu)，稱為多聚A尾。hnRNA內(nèi)含子(intron)mRNA

外顯子(exon)*真核生物mRNA成熟過程mRNA核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位mRNA的穩(wěn)定性維系翻譯起始的調(diào)控帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能*mRNA的功能把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補(bǔ)配對原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。DNAmRNA蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯原核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核DNA內(nèi)含子外顯子轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后剪接轉(zhuǎn)運(yùn)mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細(xì)胞2、tRNA的結(jié)構(gòu)與功能*

tRNA的一級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)含10~20%稀有堿基，如DHU3′末端為-CCA-OH5′末端大多數(shù)為G

具有T

C雙氫尿嘧啶(DHU)假尿嘧啶()次黃嘌呤(I)*tRNA的二級結(jié)構(gòu)——三葉草形氨基酸臂

DHU環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)

TΨC環(huán)氨基酸臂額外環(huán)tRNA的功能：活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。1、分子較小，含較多的稀有堿基和非標(biāo)準(zhǔn)堿基配對2、5’端一般為鳥嘌呤核苷酸，3’端為CCA-OH3’。3、二級結(jié)構(gòu)為“三葉草”型（cloverleafpattern）氨基酸臂：3`末端的CCA-OH3`單鏈用于連接該tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸二氫尿嘧啶環(huán)（DHU）：識別氨酰-tRNA合成酶TΨC環(huán)：識別核蛋白體（核糖體）tRNAsummary4、“倒L”型三級結(jié)構(gòu)3、rRNA的結(jié)構(gòu)與功能組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)合成的場所。核蛋白體的組成原核生物（以大腸桿菌為例）真核生物（以小鼠肝為例）小亞基30S40SrRNA16S1542個(gè)核苷酸18S1874個(gè)核苷酸蛋白質(zhì)21種占總重量的40%33種占總重量的50%大亞基50S60SrRNA23S5S2940個(gè)核苷酸120個(gè)核苷酸28S5.85S5S4718個(gè)核苷酸160個(gè)核苷酸120個(gè)核苷酸蛋白質(zhì)31種占總重量的30%49種占總重量的35%第二節(jié)核酸的理化性質(zhì)

一、酸性化合物

兩性解離，但酸性強(qiáng)

pH4.0-11.0之間最穩(wěn)定

二、高分子性質(zhì)

粘度DNA>RNA

分子大小單位：分子量（道爾頓，D）、堿基對數(shù)目（bp）、離心沉降常數(shù)（S）

微溶于水

三、紫外吸收1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0OD260的應(yīng)用

四、變性、復(fù)性、分子雜交1、DNA變性（DNAdenaturation）：DNA變性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氫鍵斷裂，堿基堆積力遭到破壞，雙螺旋結(jié)構(gòu)解體，雙鏈分開形成單鏈的過程。

方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改變增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。熱變性當(dāng)DNA的稀鹽溶液加熱到80-100℃時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開，形成無規(guī)線團(tuán)。解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。Tm：變性是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(meltingtemperature,Tm)。其大小與G+C含量成正比。影響Tm值的因素(1)溶液的性質(zhì)(2)DNA的性質(zhì)和組成大腸桿菌DNA在不同濃度KCl溶液下的熔融溫度曲線GC含量越高，Tm越大DNA越長，Tm越大溶液離子強(qiáng)度增高，Tm值增加DNA越純，相變范圍越小2、DNA復(fù)性(renaturation)

在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程又稱為退火(annealing)

。減色效應(yīng)DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260降低。在DNA變性后的復(fù)性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件（溫度及離子強(qiáng)度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在D