血細(xì)胞體外融合法八

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)室王保國505房間776533分機(jī)實(shí)驗(yàn)安排9月27日1~3節(jié)細(xì)胞融合(牛蛙血細(xì)胞)10月11日1~3節(jié)染色體制備(小鼠骨髓細(xì)胞)10月18日1~3節(jié)看錄像，實(shí)驗(yàn)考查細(xì)胞融合——牛蛙紅細(xì)胞的體外融合

了解聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)體外細(xì)胞融合的基本原理。通過PEG誘導(dǎo)牛蛙血細(xì)胞之間的融合實(shí)驗(yàn)，初步掌握細(xì)胞融合的基本方法。熟悉用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。目的要求同種細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)2個(gè)靠在一起的細(xì)胞自發(fā)合并，稱自發(fā)融合；異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合，稱誘發(fā)融合。細(xì)胞融合（cellfusion）又稱體細(xì)胞雜交（cellhybridization），是指將不同來源的兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞并使之分化再生、形成新物種或新品種的技術(shù)。來自兩個(gè)親本細(xì)胞的基因組合在一起形成只含有一個(gè)細(xì)胞核的雜交細(xì)胞（hybridcell），此雜交細(xì)胞具有很強(qiáng)的生命力，增殖旺盛。常用方法：生物方法、化學(xué)方法、物理方法。概念細(xì)胞融合的原理膜結(jié)構(gòu)：脂質(zhì)雙分子層，流動(dòng)鑲嵌模型細(xì)胞膜的流動(dòng)性：環(huán)境因素等誘導(dǎo)因素使細(xì)胞膜的脂類分子的有序排列改變

融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜的變化過程

類脂質(zhì)分子發(fā)生疏散和重排導(dǎo)致細(xì)胞橋的形成細(xì)胞質(zhì)、核相互融合顯微鏡下的細(xì)胞融合過程

PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子質(zhì)量的多聚體，具有強(qiáng)烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白質(zhì)的作用，能夠有效地促進(jìn)植物原生質(zhì)體和動(dòng)物細(xì)胞的融合。

PEG可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合。使用方便，但有一定毒性，有些細(xì)胞不適用。實(shí)驗(yàn)原理(化學(xué)法)聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過程融合過程兩細(xì)胞（或多細(xì)胞）的接觸、粘連。兩細(xì)胞（或多細(xì)胞）的細(xì)胞質(zhì)連通。通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞（或多細(xì)胞）連成一體。細(xì)胞完全合并，形成一個(gè)含有兩個(gè)（或多個(gè)）核的細(xì)胞。注意區(qū)分細(xì)胞融合和細(xì)胞重疊。牛蛙血細(xì)胞的收集：吸取1ml牛蛙血細(xì)胞懸液放入離心管→加入4mlHanks液混勻→1000rpm/min離心5min→棄去上清液，輕彈離心管混勻細(xì)胞PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合：吸取0.5ml37℃的50%PEG溶液，在37℃水浴中慢慢沿著離心管壁逐滴加入10滴，邊滴邊搖→在37℃水浴中靜置2min終止PEG作用：緩慢加入5mlHanks液，輕輕吹打混勻，于37℃水浴中靜置5min制備細(xì)胞懸液：用吸管混勻，1000rpm/min離心5min→棄去上清液，加入Hanks液2.5ml

，再混勻、離心一次，棄多數(shù)上清，留少許溶液，混勻細(xì)胞方法與步驟（融合）染色和鏡檢：載玻片上加１滴細(xì)胞懸液和１滴詹納斯綠染液混勻，染色3min→蓋上蓋玻片后鏡檢（觀察兩個(gè)高倍視野細(xì)胞融合情況）

細(xì)胞融合率：細(xì)胞融合率是指在顯微鏡的一個(gè)視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細(xì)胞(包括已融合的細(xì)胞)的細(xì)胞核總數(shù)之比，通常以百分比表示。融合的細(xì)胞核總數(shù)/所有細(xì)胞核總數(shù)×100%方法與步驟牛蛙血細(xì)胞的獲得：心臟采血、肝素抗凝牛蛙血細(xì)胞儲(chǔ)備液的制備：加4倍體積的0.85%NaCl溶液，4℃保存牛蛙血細(xì)胞懸液的制備：1ml儲(chǔ)備液加5ml0.85%NaCl溶液離心洗滌(1200轉(zhuǎn)5分鐘)2次，棄上清液，加入10mlGKN溶液混勻制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)：牛蛙血細(xì)胞的收集：吸取1ml牛蛙血細(xì)胞懸液加入4mlHanks液混勻，取10μl加入計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)（2個(gè)或4個(gè)大方格）。

原則：壓線的細(xì)胞數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右血細(xì)胞懸液制備及計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)板注意事項(xiàng)每個(gè)吸取細(xì)胞懸液的步驟，均要注意混勻細(xì)胞且要輕柔。必須嚴(yán)格控制PEG的作用時(shí)間，通常處理細(xì)胞1~2分鐘。PEG和二甲基亞砜（DMSO）并用，可以提高細(xì)胞的融合率。計(jì)數(shù)板充液應(yīng)一次充完，避免產(chǎn)生氣泡，靜置1~2分鐘后計(jì)數(shù)。注意區(qū)別血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的血蓋片與一般的蓋玻片，計(jì)數(shù)板、血蓋片用清水沖洗后，擦干收回。發(fā)展歷史Muller于1838年觀察到脊椎動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生合并的現(xiàn)象。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠?jiǎng)?chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。真正意義上的細(xì)胞工程誕生了。細(xì)胞融合現(xiàn)已成為細(xì)胞工程的核心技術(shù)之一。細(xì)胞融合的方法

生物法

、化學(xué)法及物理法。原理：增加細(xì)胞間的粘附、改變膜的通透性——隨機(jī)結(jié)合、融合1、生物因素：仙臺(tái)病毒

研究最早的促融劑。毒性大而使應(yīng)用受到限制。仙臺(tái)病毒（HVJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。因HVJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。活性與其被膜的磷脂成分有關(guān)：糖蛋白、神經(jīng)氨酸酶的突起原理與過程滅活后的病毒顆粒結(jié)合到原生質(zhì)體表面。兩受體細(xì)胞開始凝聚。兩細(xì)胞的膜緊密結(jié)合。病毒被膜與受體細(xì)胞的漿膜融合。病毒顆粒周圍的膜脫離整個(gè)膜，產(chǎn)生破口，在兩細(xì)胞間形成細(xì)胞質(zhì)通道（37℃下1-2分鐘），通道繼續(xù)擴(kuò)大，病毒顆粒流入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)互相融合。融合細(xì)胞變圓，融合結(jié)束。3、物理法——電融合誘導(dǎo)法

在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，極化產(chǎn)生偶極子，彼此靠近，定向排列成串球狀在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體膜兩側(cè)產(chǎn)生電勢(shì)，正負(fù)電荷相吸，細(xì)胞膜變薄，觸發(fā)膜的穿孔（質(zhì)膜瞬間破裂）。膜之間形成通道，細(xì)胞質(zhì)等得以交換、融合。融合方法選擇具體應(yīng)用時(shí)要根據(jù)不同對(duì)象選擇不同的細(xì)胞融合方法和條件。誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合，仙臺(tái)病毒HVJ誘導(dǎo)、PEG法、電融合法都適用；植物細(xì)胞融合常用PEG法和電融合法；微生物細(xì)胞融合只適用PEG法。細(xì)胞濃度(個(gè)/ml)=４個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)/4×10×103×稀釋倍數(shù)細(xì)胞融合率(%)=兩個(gè)視野中融合的細(xì)胞數(shù)/兩個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)×100%作業(yè)思考題預(yù)習(xí)：實(shí)驗(yàn)27制備小鼠染色體之前如何處理小鼠，為什么？對(duì)比小鼠骨髓細(xì)胞與人體外周血白細(xì)胞染色體制備的異同點(diǎn)。P50：1、2顯微鏡的使用及細(xì)胞形態(tài)觀察光學(xué)顯微鏡基本結(jié)構(gòu)照明燈粗細(xì)調(diào)節(jié)推進(jìn)器聚光器接口載物臺(tái)切片夾物鏡目鏡色差矯正（復(fù)消色差）數(shù)值孔徑1.40觀察的介質(zhì)油鏡工作距離0.21mm放大倍率指示色帶藍(lán)色—60倍彈簧物鏡保護(hù)裝置

生產(chǎn)廠家

平場矯正

放大倍率

特殊觀察方式

筒長（無限遠(yuǎn)系統(tǒng)）

蓋玻片厚度

(0.17mm)放大倍率指示色帶：紅色—4X黃色—10X綠色—20X淺藍(lán)色—40X藍(lán)色—60X白色—100X物鏡的符號(hào)

用右手握住鏡臂，左手托鏡座，從鏡箱內(nèi)取出顯微鏡，把顯微鏡放在身前稍左側(cè)的實(shí)驗(yàn)桌上，鏡臂對(duì)著胸前使鏡筒向前方。鏡座與桌邊距離約為6.66cm（2寸）適當(dāng)高度的凳子進(jìn)行操作。

顯微鏡的使用方法

?先向上轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使鏡筒上升，再轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤，使低倍鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔，即能聽到“卡扣”的固定響聲，同時(shí)手也感到有阻力，說明物鏡與鏡筒已經(jīng)成一直線。

?對(duì)光：打開光圈,旋轉(zhuǎn)聚光器升降螺旋，使聚光器升到和鏡臺(tái)平齊。用左眼在目鏡上觀察（兩眼齊睜），同時(shí)用反光鏡的凹面對(duì)向光源取光,要求視野的密度完全均勻。

?裝置玻片標(biāo)本：將標(biāo)本片有蓋玻片的一面向上置于載物臺(tái)上，玻片兩端用彈簧夾夾住，然后移動(dòng)玻片，使標(biāo)本對(duì)準(zhǔn)鏡臺(tái)孔。

?調(diào)焦：從側(cè)面觀察低倍鏡，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使鏡筒下降，當(dāng)?shù)捅剁R距標(biāo)本約0.5cm時(shí)，用左眼從目鏡上觀察，慢慢向上轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，鏡筒也隨而上升,直至視野出現(xiàn)清晰物象為止。如物象不在視野中央，可移動(dòng)玻片標(biāo)本的位置，注意玻片移動(dòng)方向與物象移動(dòng)方向恰好相反。低倍鏡的使用使用高倍鏡必須依照上述步驟先在低倍鏡下找到物象后，然后把要放大的部分移到視野的中央，調(diào)節(jié)到最清晰的程度后，才能進(jìn)行以下操作：轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤，使高倍鏡與鏡筒成一直線，轉(zhuǎn)換高倍鏡時(shí)速度要慢，特別當(dāng)心高倍鏡是否觸碰到玻片，如碰到玻片證明低倍鏡的焦距沒有調(diào)好，應(yīng)重新調(diào)節(jié)。調(diào)焦：用左眼從目鏡觀察，這時(shí)物象往往不甚清楚,可用細(xì)調(diào)節(jié)器慢慢向上或向下轉(zhuǎn)動(dòng)（切勿用粗調(diào)節(jié)器），轉(zhuǎn)動(dòng)范圍不宜過大，一般只需向上或向下轉(zhuǎn)動(dòng)一圈,就能清晰地看到物象。需要更換玻片標(biāo)本時(shí)，應(yīng)先轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使鏡筒上升之后，才能取下玻片標(biāo)本。高倍鏡的使用1.拿顯微鏡時(shí)應(yīng)右手緊握鏡臂,左手托住鏡座,防止目鏡從鏡筒滑出和反光鏡脫落。2.顯微鏡用后，必須將目鏡、物鏡、反光鏡等用清潔的擦鏡紙或綢布擦拭,切勿口吹、手摸或用粗布揩擦,勿用乙醇及其他藥物,以免侵蝕鏡臺(tái)或鏡頭。3.使用顯微鏡應(yīng)先用低倍鏡調(diào)節(jié)光源,如觀察組織細(xì)胞或染色較淺標(biāo)本時(shí),要適當(dāng)關(guān)小光圈,使物象清晰。4.放置玻片標(biāo)本時(shí),應(yīng)注意標(biāo)本的正反，把要觀察的部分對(duì)準(zhǔn)通光孔的正中央。如果標(biāo)本放反,不僅找不到物象,并且容易壓碎玻片,損傷物鏡。5.觀察時(shí)要兩眼齊睜,用左眼從目鏡中尋找物象,仔細(xì)觀察,用右眼看紙繪圖。粗、細(xì)調(diào)節(jié)器都不能做單方向的旋轉(zhuǎn)，如一直上升粗調(diào)節(jié)器會(huì)使鏡筒脫落。反之,如一直下降會(huì)壓碎玻片。6.不要隨意取出物鏡以防灰塵落入。禁止任意拆卸零件，以防意外損失。

7.顯微鏡用完后,應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使鏡筒徐徐上