透析法除玉米須多糖中小分子雜質(zhì)工藝條件優(yōu)化

透析法除玉米須多糖中小分子雜質(zhì)工藝條件優(yōu)化

玉米是水稻科的干燥血管和血管。這是1985年《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)療標(biāo)準(zhǔn)》（第一卷）中常用的藥物品種之一。常用于醫(yī)藥、茶、飲食等藥物的糖尿病和高血壓的輔助治療?，F(xiàn)代藥理研究證,玉米須有降血糖、抗癌、抑菌、增強(qiáng)免疫功能、利尿、降血壓等作用。玉米須中多糖含量較高,具有良好的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景及科研價(jià)值,但其中含有很多小分子雜質(zhì)。為提高玉米須多糖的純度,本實(shí)驗(yàn)探討透析法除去水溶性小分子雜質(zhì)的工藝方法。1循環(huán)水處理設(shè)備玉米須,2009年秋采集于吉林省吉林市郊區(qū),由吉林大學(xué)王廣樹(shù)教授鑒定為玉蜀黍(ZeamaysL.)甜黏1號(hào);葡萄糖、苯酚、乙醇、濃硫酸等均為分析純。SHB-ⅢA循環(huán)水多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;LDZ5-2臺(tái)式離心機(jī),北京市醫(yī)用離心機(jī)廠;752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),山東高密彩虹分析儀器有限公司;W2-100S恒溫水浴鍋,上海申生科技有限公司;MD25(8000-14000)透析袋,上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司等。2方法和結(jié)果2.1夜固液提取玉米須干燥后粉碎,過(guò)40目篩。準(zhǔn)確稱取100g,用石油醚脫脂后,放入5000ml的圓底燒瓶中,加20倍量的水,浸泡過(guò)夜,加蒸餾水約至3000ml,于90℃水浴提取1h,提取液過(guò)濾,第2次加水2000ml,提取30min,過(guò)濾;合并2次濾液濃縮至總體積的1/5,加無(wú)水乙醇至濃度70%以上,靜置24h,3500r/min離心5min,回收乙醇,沉淀部分真空干燥得粗多糖,備用。多糖貯備液:精確稱取粗多糖2.0g,配制成250ml多糖溶液,離心、過(guò)濾,低溫保存,待用。2.2多糖含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)按常規(guī)苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量,以葡萄糖為對(duì)照品作標(biāo)準(zhǔn)曲線,多糖含量在60-140μg/ml吸光度和多糖濃度呈良好的線性關(guān)系;A=5.91C+0.0038(n=5),r=0.9995。多糖損失率(%)=(透析前多糖含量-透析后多糖含量)/透析前多糖含量×100%。多糖得率(%)=透析后多糖含量/透析前多糖含量×100%2.3單因素考察實(shí)驗(yàn)在固定透析液和緩沖液體積比為1:50情況下,分別對(duì)透析時(shí)間(5、6、7、8h)、透析溫度(17、25、35、45℃)和更換透析液次數(shù)(2、3、4、5次)進(jìn)行單因素考察。2.3.1不同更換緩沖液次數(shù)對(duì)多糖得率影響取10ml的多糖貯備液于透析袋中,夾好透析袋夾。靜置于500ml蒸餾水中透析,透析時(shí)間為4h,溫度為17℃,考察更換緩沖液次數(shù)(2、3、4、5次)離心,棄去少量沉淀,上清液低溫真空干燥后,精密稱量。配制成50ml溶液,測(cè)多糖的吸光度(圖1)。由圖1可知,更換緩沖液4次和5次時(shí),多糖的純度變化很小,即更換透析液4次時(shí)小分子雜質(zhì)基本上透析完全;當(dāng)更換次數(shù)為5次時(shí),多糖的純度提高到40.22%,多糖的損失率卻高達(dá)10.41%。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是換緩沖液次數(shù)過(guò)多,有些聚合度較低的小分子多糖流失,使多糖的損失率增加。故選取透析液與緩沖液體積比為1∶50時(shí),更換透析液4次透析,其結(jié)果最佳。2.3.2透析時(shí)間對(duì)多糖純度的影響固定透析液與緩沖液的體積比1∶50,更換緩沖液4次,透析溫度為17℃,考察透析時(shí)間(5、6、7、8h)對(duì)透析結(jié)果的影響(圖2)。由圖2可知,透析時(shí)間為7h時(shí)多糖的純度39.07%,與其他水平相比最高,且多糖損失率相對(duì)較低;而透析時(shí)間為8h時(shí),多糖的純度沒(méi)有提高,但多糖損失率卻有所提高,其原因可能同上述情況,延長(zhǎng)透析時(shí)間同樣使聚合度較低的多糖滲透到緩沖液中,引起多糖損失率的增大。故最佳透析時(shí)間為7h。2.3.3透析溫度對(duì)多糖純度的影響固定透析液與緩沖液體積比為1∶50,更換緩沖液4次,透析時(shí)間為7h,考察溫度(17℃、25℃、35℃、45℃)對(duì)透析結(jié)果的影響(圖3)。由圖3數(shù)據(jù)可知,透析溫度在45℃的時(shí)候,多糖純度最高,且損失率最低,故選擇45℃為最佳溫度。多糖本身的性質(zhì)決定了透析溫度不能過(guò)高,溫度過(guò)高則多糖容易分解。2.4關(guān)于a.多糖多糖透析最優(yōu)條件的確定參照文獻(xiàn)方法,選擇透析時(shí)間(A)、透析溫度(B)、更換緩沖液次數(shù)(C)為因素,透析液與緩沖液體積比為固定因素,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表(表1,表2)。本實(shí)驗(yàn)采用綜合加權(quán)評(píng)分法,權(quán)重系數(shù)為0.5,分別把兩項(xiàng)中最大指標(biāo)定為100分,其他各號(hào)按下式計(jì)算:綜合評(píng)分=(多糖純度/42.6)×100×0.5+(多糖得率/99.79)×100×0.5。由極差分析結(jié)果看出,對(duì)透析率的影響因素依次為溫度>時(shí)間>次數(shù),最優(yōu)水平A2B2C1。其透析最優(yōu)條件為透析時(shí)間為7h,透析溫度為30℃,更換透析液次數(shù)為3次。在表3方差分析中可知,各因素?zé)o顯著影響,但影響趨勢(shì)同極差分析。2.5度,rsd,ld取A2B2C1正交試驗(yàn)最佳因素組合平行做3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),并把樣液量擴(kuò)大為100ml(擴(kuò)大10倍),結(jié)果如下:多糖純度為43.19%、42.32%、42.55%,平均值為42.69%,RSD為1.06%<1.5%;多糖得率為90.96%、90.52%、90.76%,平均值為90.74%,RSD為0.247%<1.5%。3次實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)分為95.56,多糖純度由27.00%提高到42.35%,多糖損失率為9.25%。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)所確定的工藝條件為最優(yōu)工藝條件,并穩(wěn)定可行。3溫度和透析時(shí)間對(duì)多糖得率影響正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)因素中各因素影響關(guān)系為B>A>C,即透析溫度>透析時(shí)間>更換緩沖液次數(shù);透析液與緩沖液體積比為1∶50時(shí)的最佳透析條件為:A2B2C1,即透析時(shí)間7h、透析溫度為30℃、更換緩沖液次數(shù)為3次;此條件下多糖的純度從27.00%提高到42.35%,多糖損失率為9.25%。本實(shí)驗(yàn)溫度影響最大單因素為45℃,但正交中為30℃,可能溫度越高透析率越高,但多糖損失率也高,所以30℃不但綜合評(píng)分高而且接近室溫,經(jīng)濟(jì)成本也低。第二位影響因素為透析時(shí)間,目前文章報(bào)道24-72h,時(shí)間很長(zhǎng),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次,每次7h,共21h,節(jié)約時(shí)間。所以此方法對(duì)于玉米須粗多糖除去小分子雜質(zhì)是十分有效的,并適合工業(yè)化生產(chǎn)。相對(duì)于其他的除雜方法,其多糖損失率低。然而此方法也存在一定的局限性,透析只能除去