血瘀證細(xì)胞損傷模型的研究

血瘀證細(xì)胞損傷模型的研究

最近的臨床和實驗表明，一些血瘀證患者或動物模型中的血液循環(huán)障礙及血塊性病理狀態(tài)與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷密切相關(guān)。從血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的角度來看，血瘀證的性質(zhì)和活血化瘀法的建立已成為一種新方法。本研究運用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),用兩種方法,即用血瘀證兔模型血管內(nèi)皮細(xì)胞直接培養(yǎng)和用血瘀證兔模型血清損傷培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,分析體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其內(nèi)分泌功能的變化,探索建立血瘀證細(xì)胞損傷模型的可行性。1材料和方法1.1動物新西蘭純種兔,雄性,體重1kg?左右,購自廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)用實驗動物場。1.2siga?成199培養(yǎng)液,為?Gibco?產(chǎn)品,胎牛血清、超級新生牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所提供;膠原酶Ⅱ型購自?Sigma?公司,胰蛋白酶購自?EML?公司;兔抗人第?Ⅷ?因子相關(guān)抗原抗血清由上海生物制品研究所提供,羊抗兔?I?gG?熒光抗體由軍事醫(yī)科院微生物流行病研究所提供;牛血清白蛋白由新疆生化廠生產(chǎn),去甲腎上腺素由廣州明興制藥廠生產(chǎn)。內(nèi)皮素(ET)碘標(biāo)記放免藥盒由解放軍總醫(yī)院東亞所提供,一氧化氮(NO)測試盒由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供。1.3型造模方法20只新西蘭兔隨機均分為正常對照組和血瘀證組。按我們以前報道的血瘀證兔模型造模方法,于兔耳靜脈緩慢注射去甲腎上腺素0.1mg·kg-1·d-1,連續(xù)20d;于造模第1天同時靜注牛血清白蛋白250mg/kg,間隔10d,再注射1次,共2次。正常對照組于同期注射等量生理鹽水。1.4血清實驗造模結(jié)束后(第21天)分別抽取兩組動物的全血并分離兔血清,混勻除菌過濾及滅活后,4℃保存?zhèn)溆谩?.5細(xì)胞培養(yǎng)方法1:每次實驗各取血瘀證組和對照組兔1只,分離出主動脈,先后用胰蛋白酶和膠原酶消化,將獲取的內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)整至5×104～1×105/mL,以3mL?細(xì)胞液種于培養(yǎng)皿,在50%?CO2?培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。細(xì)胞原代培養(yǎng)8～10d后,細(xì)胞呈單層密集生長,近亞融合時,進(jìn)行傳代繁殖培養(yǎng)。方法2:分離2～3只正常新西蘭兔的主動脈,同方法1用酶消化血管內(nèi)皮細(xì)胞后,將細(xì)胞混合在一起進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。將第5代呈單層融合的20瓶血管內(nèi)皮細(xì)胞隨機均分為2組,分別加入含體積分?jǐn)?shù)為10%?自制的正常兔和血瘀證兔血清培養(yǎng)液,靜置培養(yǎng)24h。1.6電鏡觀察觀察內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定采用第?Ⅷ?因子間接免疫熒光檢查。內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征采用倒置顯微鏡和電鏡觀察。電鏡檢查方法:分別收集原代、傳代培養(yǎng)及自制血清處理后的2組內(nèi)皮細(xì)胞,按常規(guī)電鏡樣品制備法制備樣品,用日電?JEM-100CX?Ⅱ/T?型透射電鏡和?JSM-J300型掃描電鏡觀察。1.7內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)囊功能指標(biāo)的檢測1.7.1皮細(xì)胞融合、培養(yǎng)液制備分別收集原代和第5代培養(yǎng)的各組內(nèi)皮細(xì)胞融合24h?后以及經(jīng)兩組兔血清作用24h后的培養(yǎng)液,4℃離心,取上清-20℃?保存。1.7.2細(xì)胞液測定和測定ET?檢測按碘標(biāo)記放免藥盒說明書操作,使用儀器為?BeckmanGamma5500自動計數(shù)器,采用非平衡放射免疫法直接測定細(xì)胞液?ET?含量,結(jié)果以?ng/L?表示。1.7.3血漿中no穩(wěn)定代謝產(chǎn)物的檢測按藥盒說明書進(jìn)行操作,使用?Pharmacia4000型紫外分光光度計檢測血漿中?NO-2(NO穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物之一)含量,以?NO-2?含量表示?NO?生成量,結(jié)果以?μmol/L?表示。1.8正態(tài)分布和方差齊時各組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后,屬正態(tài)分布和方差齊時,采用?t檢驗統(tǒng)計方法;若屬非正態(tài)或方差不齊時,采用?Wilconxon?檢驗。2結(jié)果2.1原代內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和內(nèi)皮細(xì)胞的功能特點2.1.1兩組原代內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特征比較結(jié)果見表1。2.1.2no?et?含量測定情況見表2。結(jié)果表明血瘀證組原代培養(yǎng)液中的?NO?含量比正常對照組降低(P<0.01),ET?含量與正常對照組相比有增加趨勢,但差異無顯著性(P>0.05)。2.2代代相傳內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)以及內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)因功能特征2.2.1兩組傳代內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)在功能比較見表3。結(jié)果表明模型組傳代培養(yǎng)液中?ET、NO?的含量與正常對照組相比,差異均無顯著性(P>0.05)。2.2.2兩組傳代內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特征傳代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)第?Ⅷ?因子間接免疫熒光檢查,證實培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。正常組和血瘀證組傳代培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征比較見表4。2.3兩組均血清對培養(yǎng)的正常內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及其內(nèi)政部功能的影響2.3.1兩組兔子血清對培養(yǎng)的正常內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)特征的影響見表5。2.3.2血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中et、no見表6。結(jié)果表明,經(jīng)兔血清24h?處理后,與正常血清組相比,血瘀血清組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中?ET、NO?的含量都明顯增加(P<0.01)。3形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞的含量?近年來,為了深入研究血瘀證及活血化瘀治則,人們建立了各種血瘀證動物模型,這對于闡明血瘀證的某些基本理論,篩選有效方藥,補充臨床研究之不足,起著重要的作用。但由于這些模型都屬于在體研究,受神經(jīng)、體液等因素的影響,使其對血瘀證實質(zhì)及活血化瘀方藥作用機理的闡明受到一定的限制。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)作為體外實驗的一種重要方法,可人為控制、干預(yù)各種影響因素,彌補體內(nèi)實驗之不足。用主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行疾病的發(fā)病機理或活血化瘀藥物作用機理的研究,國內(nèi)外已有較多的報道,大多數(shù)從正常動物或人身上取材,然后在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中加入高脂血清、纖維蛋白等處理因素造成細(xì)胞的病理損傷。這些研究方法已在活血化瘀方藥的篩選及闡明其機理方面發(fā)揮著重要作用,但不足之處是這種病理性損傷不能直接反映體內(nèi)的“血瘀證”病理狀態(tài),只能作為一般細(xì)胞損傷模型,而不能作為血瘀證細(xì)胞損傷模型。本研究首先從已造模的整體血瘀證兔主動脈直接取材,進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng),并與正常對照組兔內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其內(nèi)分泌功能進(jìn)行比較,觀察其能否保持體內(nèi)的病理特征。在實驗中,除了用光鏡和電子顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)外,我們還檢測了細(xì)胞培養(yǎng)液中的?ET?和?NO?含量。近來研究表明,血管內(nèi)皮細(xì)胞作為一種內(nèi)分泌器官能不斷地分泌各種血管活性物質(zhì),其中就包括?ET?和?NO。ET?是迄今所知最強的縮血管多肽物質(zhì),NO?則具有舒血管作用,并能抑制血小板的聚集和粘附。ET?和?NO?在對血管舒縮運動中起著平衡調(diào)節(jié)作用,血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)分泌功能紊亂引起的兩者平衡失調(diào)將導(dǎo)致血液循環(huán)系統(tǒng)的障礙。實驗結(jié)果表明,與正常兔比較,模型組兔原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其病理結(jié)構(gòu)改變,如細(xì)胞體積增大,細(xì)胞內(nèi)飲液泡數(shù)量增多,部分細(xì)胞線粒體腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張等。另外,模型組原代細(xì)胞培養(yǎng)液中?NO?的含量比對照組明顯減少,而?ET?含量則有上升趨勢。這些都在一定程度上反映出與血瘀證整體動物模型的病理狀態(tài)相一致。本實驗將原代培養(yǎng)的兔模型組內(nèi)皮細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng),當(dāng)傳至第5代時,無論是光鏡還是電鏡檢查,原代培養(yǎng)時內(nèi)皮細(xì)胞所表現(xiàn)的病理結(jié)構(gòu)特征并未隨傳代而得以完全保留,損傷的內(nèi)皮細(xì)胞隨著細(xì)胞傳代而被逐漸淘汰。模型組傳代培養(yǎng)液中?ET、NO?等活性物質(zhì)的含量與正常對照組基本一致,說明內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)分泌功能得以恢復(fù),也體現(xiàn)了細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能變化的統(tǒng)一。這是否由于細(xì)胞生長過程中其自身的新陳代謝作用及培養(yǎng)液中所含的營養(yǎng)因素如胎牛血清等導(dǎo)致細(xì)胞的自我修復(fù),尚有待進(jìn)一步研究。我們用血瘀證兔模型血管內(nèi)皮細(xì)胞直接培養(yǎng)的方法,初步建立了血瘀證的細(xì)胞損傷模型,但由于原代培養(yǎng)的細(xì)胞損傷模型從開始整體造模到細(xì)胞模型建立的周期較長,且有一定難度,難以保留或復(fù)制。為此,我們設(shè)計了第二條途徑,即用血瘀證兔模型血清損傷培養(yǎng)的正常兔血管內(nèi)皮細(xì)胞方法,研制一種既能反映模型兔體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的病理狀態(tài)而又易于復(fù)制的血瘀證細(xì)胞損傷模型。第二種方法的實驗結(jié)果表明,血瘀證兔模型血清造成體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷,細(xì)胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)的病理變化與用第一種方法原代培養(yǎng)的細(xì)胞觀察到的相類似。同時我們發(fā)現(xiàn),經(jīng)正常、模型兩組兔血清作用24h?后,培養(yǎng)液中?ET?和NO?含量都顯著增加,其中?NO?含量的變化與在用第一種方法建立的血瘀證細(xì)胞損傷模型培養(yǎng)液中以及血瘀證整體動物模型體內(nèi)的情況不同。NO?是由?L-精氨酸和分子氧在一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)催化下生成的,NOS?可分為組成型NOS(cNOS)和誘導(dǎo)型NOS?(iNOS)。目前已證實,NO?具有雙重性,體內(nèi)適量的?NO(由?cNOS?催化合成)參與機體的生理調(diào)節(jié)功能,舒張血管和抑制血小板聚集;在病理狀態(tài)下,過量的?NO(由?iNOS?催化合成)可導(dǎo)致正常組織細(xì)胞的損傷,具有細(xì)胞毒性作用,據(jù)此推測本實驗細(xì)胞培養(yǎng)液中的?NO?含量增加可能與模型血清刺激導(dǎo)致?iNOS?被激活有關(guān)。綜上所述,本研究在我們以往的在體血瘀證動物模型研究基礎(chǔ)上,用血瘀證兔模型血管內(nèi)皮細(xì)胞直接培養(yǎng)和用血瘀證兔模型血清損傷培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞兩種