組織培養(yǎng)技術(shù)

第五章組織培養(yǎng)技術(shù)第一節(jié)植物組織培養(yǎng)所謂植物組織培養(yǎng)廣義又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織.器官或細(xì)胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。狹義上是指用植物各部分組織，如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進(jìn)行培養(yǎng)獲得再生植株，也包括在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植株。一、概述（一）概念1植物組織培養(yǎng)：是指通過無菌操作，把植物的外植體接種于人工配置的培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其成為完整植株的方法。2外植體：是指用于植物組織培養(yǎng)的接種材料，它包括植物體的各個(gè)器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。3愈傷組（Callu原指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團(tuán)薄壁細(xì)胞，在組培中則指人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團(tuán)無序生長的薄壁細(xì)胞。（二）組織培養(yǎng)類型1養(yǎng)養(yǎng)3養(yǎng)培養(yǎng)；.；；.；史是0。過階；2家t。9年e，t與t。羅士韋是我國植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)研究的開拓者和奠基人之一（四）植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用⒈植物的快速繁殖：⑴園藝、花卉植物的大規(guī)?？焖俜敝常虎茡尵葹l危珍稀植物⑶進(jìn)行某些植物的種質(zhì)資源保存⒉培育無病毒的植物，如脫病毒草莓等；⒊制造人工種子。4突變體的篩選培育5藥用植物的工廠化生產(chǎn)6花藥培養(yǎng)和花粉單倍體育種7基因工程的應(yīng)用等二、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì) 一般具有：1.準(zhǔn)備室器皿洗滌，培養(yǎng)基配制、分裝、高壓滅菌，植物材料的預(yù)處理，重蒸餾水的制備以及進(jìn)行生理、生化因素的分析等各種操作都要在此室中進(jìn)行.2.緩沖室進(jìn)入無菌室前需在緩沖室里換上經(jīng)過滅菌的衛(wèi)生服、拖鞋，戴上口罩。最好安裝1盞紫外燈，用以滅菌。3.無菌操作室也稱接種室。主要有超凈工作臺(tái)、空調(diào)機(jī)、醫(yī)用小平車等4.培養(yǎng)室具備適宜的溫度濕度光照通風(fēng)等條件有培養(yǎng)架子和燈光；通風(fēng)設(shè)施；邊臺(tái)；5.馴化室和溫室（二）常用設(shè)備1．超凈工作臺(tái)2.無菌箱3．空調(diào)機(jī)4．除濕機(jī)5．恒溫箱又稱培養(yǎng)箱6．烘箱7．高壓滅菌器8．冰箱9．天平10．顯微鏡11．搖床或轉(zhuǎn)床12．酸度計(jì)等（三）器皿用具1培養(yǎng)器皿器皿按材料分有玻璃器皿與塑料器皿兩種按其形狀分主要有試管、三角瓶、圓形培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿L型管和T型管等2、分注器3、離心管4、移液管5、細(xì)菌過濾器6、器械用具：鑷子、剪刀、接種工具、大解剖刀等7、實(shí)驗(yàn)器皿三、培養(yǎng)基及其配制（一）培養(yǎng)基的種類：1.根據(jù)態(tài)相不同分為：固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基2.根據(jù)培養(yǎng)過程分為：初代培養(yǎng)基與繼代培養(yǎng)基。3.作用不同分為：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。4.根據(jù)營養(yǎng)水平不同分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基主要有MS、WhitB5N6良SrhierH基質(zhì)。分 ：1素2、維生素類：B族維生素，如硫胺素（維生素B1、吡哆醇（維生素B6、煙酸（維生素B3，又稱維生素PP）和泛酸鈣（維生素B5、葉酸（維生素Bc、抗壞血酸（維生素C）等3酰（如天門冬酰胺和多種氨基酸的混合）等4，5：6哚（A（A（A-酸)哚（A（A（T-（A、（T。7碳（三）培養(yǎng)基配制1水和藥品的準(zhǔn)備：2器皿和用具的準(zhǔn)備：不同型號(hào)的燒杯、容量瓶、移液管、滴管、玻璃棒、三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基分裝器等3.母液的配制和保存：經(jīng)常使用的培養(yǎng)基，可先將各種藥品配成濃縮一定倍數(shù)的母液放入冰箱內(nèi)保存用時(shí)再按比例稀釋一般配成大量元素微量元素、鐵鹽、維生素、氨基酸等母液；生長調(diào)節(jié)物質(zhì)也可分別配制成溶液，儲(chǔ)存于冰箱（1）配制MS大量元素母液一般將大量元素分別配制成100倍的母液，使用時(shí)再分別稀釋100倍。分別稱取NH4NO3165、KH2PO417、KNO3190、CaCl2·2H2O44、MgSO4·7H2O37g各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。（2）配制MS微量元素母液一般將微量元素配制成100倍母液。依次稱取KI0.083g、Na2MoO·2H2O0.025、H3BO30.62、MnSO4·H2O1.69、CuSO4·5H2O0.0025、CoCl6H2O0.0025ZnSO47H2O0.86g配成1L入L放。4·O和2·O由于稱取量很小，如果天平精確度沒有達(dá)到萬分之一可先配成調(diào)整液即先分別稱取CuSO45H2O0.05gCoCl26H2O0.05g、各自配成100mL的調(diào)整液，然后取5mL就還有0.0025g的量。（3）配制MS有機(jī)母液一般配制成100倍MS有機(jī)母液依次稱取肌醇10g鹽酸硫胺（VB10.01、煙酸0.05酸g（6g成L入L劑。（4制S液成0倍S取A鈉g、4·g成L入L。（5制先量%或1的H用1溶取g成L。.培養(yǎng)基的配制及其滅菌：應(yīng)當(dāng)注意的是，某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)如IA、T、A行毒點(diǎn)S基鹽富e基：低6基是K3和（N4）24。4.B5培養(yǎng)基：特點(diǎn)是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。四、植物組織培養(yǎng)基本操作和培養(yǎng)技術(shù)（一）玻璃器皿清洗（二）培養(yǎng)基配制（三）外植體的選擇和滅菌操作技術(shù)基本要點(diǎn)：一是要?jiǎng)?chuàng)造無菌的條件；二是要在無菌的適當(dāng)條件下培育植物材料，這就必須注意材料的選擇、培養(yǎng)基的組成、激素的應(yīng)用、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件等等。1.選擇優(yōu)良種質(zhì)、健壯的植株、選擇最適時(shí)期、選取適宜大小2.外植體的滅菌：外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進(jìn)行預(yù)處理。植物材料一般采取預(yù)處理是，先對植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要部分，在流水中沖洗干凈。經(jīng)過預(yù)處理植物材料，其表面仍有很多細(xì)菌和真菌，因此還需進(jìn)一步滅菌。常用滅菌劑使用濃度及效果比較表滅菌劑名稱 使用濃% 消毒難易 滅菌時(shí)間 滅菌效果酒精 7～75 易 0.～3 好氯化汞 0.～0.2 較難 2～10 最好漂白粉 飽和溶液 易 5～30 很好次氯酸鈣 9～10 易 5～30 很好次氯酸鈉 2（活性氧） 易 5～30 很好過氧化氫 1～12 最易 5～15 好抗菌素 4～50mg/L 中 3～60 較好（五）無菌培養(yǎng)（接種后的外植體應(yīng)送到培養(yǎng)室去培養(yǎng)）1培養(yǎng)條件最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣等。光照普通要求每日光照12～16，光強(qiáng)1000l～5000lx；溫度大多數(shù)植物最適溫度在23C～32C之間。一般所用的溫度是25C±2C。低于1C或高于35C，對生長都是不利；濕度一是培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度，它的濕度條件?？杀ＷC100。二是培養(yǎng)室的濕度。要求室內(nèi)保持70%～80%的相對濕度?！鷤M織在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間后由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭水分散失以及積累一些組織代謝產(chǎn)物，因此必須將組織轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基上。這種轉(zhuǎn)移過程稱為繼代或稱傳代。一般在25C～28C下進(jìn)行固體培養(yǎng)時(shí)，每隔4～6周進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。（六）定期檢查和觀察在培養(yǎng)中易出現(xiàn)下列現(xiàn)象：1.出現(xiàn)污染現(xiàn)象2.外植體的褐化現(xiàn)象3.培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象※菌類污染、褐化和玻璃化稱為植物組織培養(yǎng)的3大難題1.污染的原因:從病源菌方面,主要有細(xì)菌及真菌兩大類；從污染的途徑，主要是由于外植體帶菌、培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。2、污染的預(yù)防措施:※防止材料帶菌的措（1用莖尖作外植體時(shí)可在室內(nèi)或無菌條件下對枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（2）避免陰雨天在田間采取外植體3）目前對材料內(nèi)部污染還沒有令人滿意的滅菌方法※外植體的滅菌（1）多次滅菌法2）多種藥液交替浸泡法※器皿與金屬器械的滅菌；※布質(zhì)制品的滅菌；※無菌操作室的滅菌；※操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無菌操作的程序進(jìn)行。外植體的褐變及其預(yù)防措施1原因褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物多少和多酚氧化酶活性有直接關(guān)系。2、影響褐變的因素隨著植物種類基因型外植體的部位及生理狀況等的不同褐變的程度也有所不同。3、褐變的預(yù)防措施：選擇適宜的外植體；采用適宜的培養(yǎng)基和光溫條件；在培養(yǎng)基中加活性炭、抗氧化劑和其他抑制劑；縮短轉(zhuǎn)瓶周期；培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施1、什么叫玻璃化現(xiàn)象？與正常苗有顯著差:其葉嫩梢呈水晶透明或半透明植株矮小腫脹失綠葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表皮缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織；體內(nèi)含水量高，但干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低。2、玻璃化的原因：激素濃度；瓊脂濃度；溫度；光照時(shí)間；通風(fēng)條件；離子水平；3、預(yù)防玻璃化的措施：適當(dāng)控制培養(yǎng)基中無機(jī)營養(yǎng)成分；適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度；適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度增加自然光照控制光照時(shí)間度改質(zhì)；栽.點(diǎn)境:；第1第2，第3氣第4弱。.化，高率。.栽：節(jié) 養(yǎng)、點(diǎn)壁慢感成養(yǎng)0化性，a胞懸浮生長型細(xì)胞：如血液白細(xì)胞，淋巴組織細(xì)胞等三、體外培養(yǎng)特點(diǎn)營養(yǎng)條件苛刻適應(yīng)性差,敏感培養(yǎng)時(shí)間長，易污染四、體外培養(yǎng)條件溫度，37度pH：7.2-7.4氣體：氧，二氧化碳，氮?dú)鉅I養(yǎng)條件：需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可以由血清提供五、體外細(xì)胞生長增殖過程原代培養(yǎng)期；傳代培養(yǎng)期；衰退期六、設(shè)備、試劑及培養(yǎng)基的選擇和配制1.設(shè)備包括培養(yǎng)箱(特別是二氧化碳培養(yǎng)箱)、無菌室或者超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡特別是倒置顯微鏡各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶(包括無鉀玻璃的或無毒塑料的封閉式的或螺口式的等)2.常用試劑有抗生素貼壁因子生長因子還需要激素凝集素脂多糖(LPS)、各種營養(yǎng)劑胰酶、膠原酶、EDTA、各種生物緩沖劑等3.培養(yǎng)基的選擇和配制培養(yǎng)基由三部分組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清和基質(zhì)。自行配制或用現(xiàn)成的化學(xué)合成培養(yǎng)基常用的化學(xué)合成培養(yǎng)基有Eagle(包括BME、MEMDME等)F10F1199RPMI1640EBSHBSSMcCoy‘s5aFshe’s、BGb、Swi‘sS77等；培養(yǎng)中血的度范為5％～20％，以10％濃度最為用；維某些胞在外生機(jī)增殖，需要先培養(yǎng)中添加纖黏、昆氨、白膠之的壁因。一般用水粉配培養(yǎng)基，過濾和集；七、培養(yǎng)方法懸滴；旋轉(zhuǎn)管；灌注小室；培養(yǎng)瓶；培養(yǎng)板八、組織培養(yǎng)的污染、檢測和排除1.污染的主要途徑和媒介的發(fā)生空氣、清洗消毒、操作、血清、組織2.組織細(xì)胞污染的檢測真菌污染細(xì)菌污染支原體污染3.組織細(xì)胞污染的排除抗生素除菌法、加溫除菌法、動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法九、細(xì)胞培養(yǎng)物在液氮中的保存和復(fù)蘇(一)培養(yǎng)物在液氮中的保存二)凍存細(xì)胞的復(fù)蘇三)細(xì)胞培養(yǎng)物凍存和復(fù)蘇中的安全措施十、動(dòng)物組織培養(yǎng)的一些新應(yīng)用(一)組織工程組織工程用于重建組織和器官，強(qiáng)化組織和器官的功能。(二)毒理學(xué)研究細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可用來作為毒理學(xué)試驗(yàn)的重要手段。(三)骨溶解病變過程的觀察(四)細(xì)胞衰老的研究(五)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的研究十一克隆技術(shù)及其應(yīng)用根據(jù)克隆的層次分為基因克隆、細(xì)胞克隆、組織克隆、器官克隆及完整的生物體克隆。(1基因克隆是指通過分子重組技術(shù)或是擴(kuò)（如PCR擴(kuò)增DNA片斷的相同序列的大量拷貝，它是深入研究基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)化、表達(dá)、調(diào)控及進(jìn)行基因改造的基礎(chǔ)。常用的目的基因克隆技術(shù)包括：①通過已知基因產(chǎn)物的分析和鑒定，進(jìn)一步確定氨基酸順序后推斷出編碼該蛋白質(zhì)的基因序列，然后通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR引物來分離目的基因。②通過遺傳表型分析的基因克隆，首先通過物理、化學(xué)或是生物的方法引起某一基因失活或過量表達(dá)，產(chǎn)生一些突變體，然后找出突變體文庫和野生型文庫中的差異，分離目的基因。③以圖譜為基礎(chǔ)的定位克隆技術(shù)，該技術(shù)在分離未知產(chǎn)物的基因方面有廣闊的應(yīng)用前景。該法的基本前提是基因定位，然后以緊密連鎖的分子標(biāo)記為起點(diǎn)，通過染色體步移逐步向目標(biāo)基因靠近，最終克隆基因。隨著基因組測序及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，還有根據(jù)同源序列進(jìn)行克隆，使電子PCR進(jìn)行克隆及使用DNA芯片技術(shù)進(jìn)行新基因篩選和克隆等許多新的方法，使基因克隆的效率不斷提高。(2)細(xì)胞克隆組織克隆和器官克隆是克隆技術(shù)在細(xì)胞水平組織水平和器官水平上的應(yīng)用，可用來生產(chǎn)大量相同的細(xì)胞、組織和器官。細(xì)胞克隆技術(shù)在制備單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)中運(yùn)用較多。(2)動(dòng)物克隆。①科學(xué)家選取了三只母羊，通過顯微操作先將一只母羊的卵細(xì)胞