聚酰胺薄膜層析法分離氨基酸

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告題目聚酰胺薄膜層析法分離氨基酸一DNS-CI法姓名：余振洋 學(xué)號(hào)：200900140156 系年級(jí)：09級(jí)生科3班同組者：張剛剛 時(shí)間：2011/4/16?【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私獠⒄莆誅NS-氨基酸制備和鑒定的原理及方法。掌握聚酰胺薄膜層析法分離氨基酸的操作和方法。二.【實(shí)驗(yàn)原理】熒光試劑5-二甲氨基T-萘磺酰氯(5-dimethylaminoT-naphthylenesulfonylchloride,Dansylchloride，簡(jiǎn)稱DNS-Cl)在弱堿性(pH9.0左右)條件下可與氨基酸的a-氨基反應(yīng)，生成帶黃色熒光的DNS-氨基酸。N(CH弟+C-CQOH-SOjdPH9.9.37°C,+C-CQOH-SOjdPH9.9.37°C,1hSOj-NH-C-COOHDNS—Cl 氨基酸DNS—氨基酸DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜層析法分離，所得層析圖與DNS-標(biāo)準(zhǔn)氨基酸層析圖譜相對(duì)比，可借此鑒定樣品中氨基酸的種類，用此法鑒定蛋白質(zhì)N-末端氨基酸比FDNB法靈敏100倍，僅10-10?10-9mol樣品即可檢出，產(chǎn)物也比DNP-氨基酸穩(wěn)定，且操作簡(jiǎn)便、快速。DNS-Cl在pH值過高時(shí)，會(huì)水解產(chǎn)生副產(chǎn)物DNS-OH，反應(yīng)時(shí)如下：ch3ch3\/ch3ch3\/NCH\嚴(yán)N+HQSO.CISO.CIDNS-ClSOeOHDNS-OH

在DNS-Cl過量時(shí)，又會(huì)產(chǎn)生DNS-NH2,反應(yīng)式如下:在紫外光照射下，DNS-OH和DNS-NH2產(chǎn)生藍(lán)色熒光，而DNS-氨基酸產(chǎn)生黃色熒光，可彼此區(qū)分開。三．【實(shí)驗(yàn)材料】器材:小離心管紫外燈（波長(zhǎng)254nm或265nm）。37°C恒溫水浴。電吹風(fēng)。層析缸（10cmX20cm）。毛細(xì)管（點(diǎn)樣管）。聚酰胺薄膜。容量瓶（100ml）。移液管（2ml）。培養(yǎng)皿,移液槍,移液管。試劑：DNS—Cl丙酮溶液：稱取25mgDNS—Cl溶在10ml丙酮中。展層液：甲酸：水=1.5:100（V/V）。氨基酸樣品：標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸以及混合氨基酸液。四．【實(shí)驗(yàn)步驟】DNS-氨基酸的制備取4只離心管，分別加入標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸及混合氨基酸30口1,再各加入DNS—Cl丙酮溶液30口1,混勻后放入37°C恒溫水浴中保存1h。點(diǎn)樣取聚酰胺薄膜一張，在距離一端1cm處用鉛筆畫一直線，在直線上取間距1cm的四點(diǎn)，作為點(diǎn)樣原點(diǎn)。用毛細(xì)管取上步制得的DNS-氨基酸液進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣直徑不超過2mm，重復(fù)2—3次，每次點(diǎn)樣后用冷風(fēng)吹干再點(diǎn)下一次，吹干。展層將上述聚酰胺薄膜光面向外卷曲（兩邊不接觸）外扎以牛皮筋，直立于盛有展層液12-13m1的培養(yǎng)皿蓋或10ml的培養(yǎng)皿底中，蓋上500ml燒杯。當(dāng)展層劑上升到距離頂端大約0.5cm時(shí)結(jié)束，取出，冷風(fēng)吹干。結(jié)果觀察將聚酰胺薄膜置于紫外燈下，觀察熒光斑點(diǎn)，區(qū)分DNS-氨基酸，DNS-NH2與DNS-OH，用鉛筆在黃綠色斑點(diǎn)邊緣輕輕畫圖做記號(hào)，將樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比找出各種氨基酸相應(yīng)的位置。五．【注意事項(xiàng)】1?在DNS-氨基酸制備時(shí)，DNS化必須在堿性條件下（pH9.0左右）進(jìn)行，否則會(huì)有很多副產(chǎn)物DNS—NH2或DNS—OH產(chǎn)生。點(diǎn)樣點(diǎn)要小、圓、量要適當(dāng)，否則拖尾，因此毛細(xì)管要細(xì)，頭要平，點(diǎn)上后立即拿開，樣品濃度要合適，聚酰胺薄膜要選擇優(yōu)質(zhì)的。點(diǎn)樣直徑不宜超過2mm,點(diǎn)樣后立即吹干，同時(shí)點(diǎn)樣力度不宜過大，防止把薄膜穿透而影響最終結(jié)果。點(diǎn)樣點(diǎn)間距不能太小，以免相互干擾；點(diǎn)樣點(diǎn)距薄膜邊緣不能太近，否則會(huì)產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。每次點(diǎn)樣后，立即吹干，才可進(jìn)行下一次點(diǎn)樣，否則液體擴(kuò)散，點(diǎn)樣面積過大，影響展層效果。展層劑液液面要低于點(diǎn)樣點(diǎn)，但也不能太低。紫外光對(duì)人體有害，因此要盡量縮短在紫外燈下的觀察時(shí)間，注意不要把頭伸到燈下觀察。六?【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1?繪圖441122圖一 DNS氨基酸聚酰胺薄膜層析結(jié)果(1.DNS-Ala2?DNS-Phe3?DNS-Lys4.DNS—雙—Lys)2?Rf值的計(jì)算:Rf=注：上式中x代表色斑中心至原點(diǎn)中心的距離，Y代表展層劑前緣至原點(diǎn)中心的距離。其中，Y值經(jīng)測(cè)量，統(tǒng)一為5.7cm。在混合氨基酸中：對(duì)于丙氨酸：Xl=3.50cm，貝URfl=0.61對(duì)于苯丙氨酸：X2=1.50cm，貝jRf3=0.26對(duì)于賴氨酸：X3=0.90cm，貝jRf3=0.16X4=4.50cm，則Rf4=0.79各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸與混合氨基酸中的對(duì)應(yīng)成分Rf值相同。七．【結(jié)果分析及討論】從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以分析出：混合氨基酸中同時(shí)含有賴氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸三種氨基酸。同時(shí)可以看到，薄膜上代表同一氨基酸的熒光點(diǎn)的位置并不完全在同一水平線上，而相互有錯(cuò)落，造成這種現(xiàn)象的原因可能有：點(diǎn)樣時(shí)用力過大，導(dǎo)致聚酰胺薄膜斷裂，影響層析結(jié)果，可能會(huì)導(dǎo)致心形黃綠色熒光斑出現(xiàn)。點(diǎn)樣時(shí)不及時(shí)吹干，致使點(diǎn)樣液擴(kuò)散，會(huì)在很大程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以要嚴(yán)格控制點(diǎn)樣點(diǎn)的大小，最好不要超過2mm；同時(shí)點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)重復(fù)2-3次，防止點(diǎn)樣液成分不足或者沒有點(diǎn)上。點(diǎn)樣時(shí)若兩點(diǎn)之間間隔過小，使得點(diǎn)樣點(diǎn)之間相互影響，從而影響了最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)宜控制在lcm左右。展層劑液面高于點(diǎn)樣點(diǎn)，使得DNS-氨基酸部分溶解在了展層液里，影響了最終結(jié)果。用鉛筆畫起始的橫線時(shí)，力度過大，形成了一條凹槽，對(duì)于層析會(huì)有不同程度的阻礙作用。圖中，賴氨酸有兩個(gè)黃綠色熒光斑點(diǎn)，說明它和DNS-Cl反應(yīng)有兩種產(chǎn)物。這是因?yàn)椋篖ys含有兩個(gè)氨基，因此Lys帶有兩個(gè)黃綠色熒光標(biāo)記。又由于DNS-Cl主要與a-氨基反應(yīng)，由此可判斷最上方的少量黃綠色熒光的是Lys的6-氨基反應(yīng)后的DNS-Lys。查閱資料得到以下幾條結(jié)論：DNS-丙氨酸的相對(duì)分子質(zhì)量體積最小，非極性最強(qiáng)，形成氫鍵最弱，展層速度最快，因而在最上方；而Lys由于與聚酰胺表面形成2個(gè)氫鍵，極性強(qiáng)，所以展層速度慢；Phe的極性處于兩者之間，因而展層速度也在兩者之間。所以本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果主要與氨基酸的極性和所形成的氫鍵有關(guān)。聚酰胺薄膜層析是一類特殊的分配層析?；旌衔镫S展層液通過聚酰胺薄膜時(shí)，由于被分離氨基酸與薄膜形成氫鍵，而各氨基酸形成氫鍵的能力不同，決定吸附力的差異，吸附力強(qiáng)，展層速度慢，吸附力弱，展層速度快。導(dǎo)致所展示的層析結(jié)果。展層液與被分離氨基酸在聚酰胺離子表面競(jìng)爭(zhēng)形成氫鍵，展層液使被分離氨基酸在展層液與聚酰胺薄膜表面之間的分配系數(shù)有較大差異。易溶于展層劑的所受的動(dòng)力作用大，展層速度快，反之，速度慢。附：一．聚酰胺薄膜層析法中對(duì)展層劑有什么要求，應(yīng)具備什么特點(diǎn)？能與不同的氨基酸形成不同程度的氫鍵，從而造成吸附力的差異，即展層速度的快慢，最終保證展層過程順利完成。展層速度要快，單析（7X7cm）—般只需15-20min。不會(huì)將氨基酸或者聚酰胺薄膜破壞，影響其實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4．被分離物質(zhì)在溶劑與聚酰胺薄膜表面之間的分配系數(shù)有差異。5．展層劑的組成應(yīng)該是固定的，因此配制時(shí)各組分比例要正確。6．展層劑的純度要注意，一般溶劑采用分析純?cè)噭┘纯?，必要時(shí)可精制后使用。二?影響Rf值的因素Rf值是色譜法中表示組分移動(dòng)位置的一種方法的參數(shù)，定義為溶質(zhì)遷移距離與流動(dòng)相遷移距離之比。一般來說，每種物質(zhì)都有其固定的Rf值。它的影響因素主要有下：物質(zhì)結(jié)構(gòu)：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑（水）中，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑（有機(jī)溶劑）中。所以物質(zhì)的極性大小決定了物質(zhì)在水和有機(jī)溶劑之間的分配情況。例如酸性和堿性氨基酸極性大于中性氨基酸。所以前者在水（固定相）中分配較多，因此Rf值低于后者。溶質(zhì)與溶劑間的相互作用：這種影響是由溶質(zhì)與溶劑間的相互作用與分配系數(shù)的關(guān)系所決定的。溶質(zhì)與溶劑之間若能形成氫鍵，對(duì)分配系數(shù)的影響就很大。pH值：這種影響主要是由pH與分配系數(shù)的關(guān)系所決定的。弱酸與弱堿的解離度受pH影響很大，解離度越大，極性越強(qiáng)，極性強(qiáng)的物質(zhì)在兩相溶劑中分配時(shí)，偏向于極性強(qiáng)的一相，這樣，改變pH就會(huì)同時(shí)改變分配系數(shù)，從而使Rf也會(huì)相應(yīng)變化。濾紙：濾紙本身的pH及含水量對(duì)Rf值的影響很大，所以不同的濾紙得到不同的Rf值及不同的斑點(diǎn)形狀。紙上含水量的多少隨溶劑與紙對(duì)水的親和力的大小而異，質(zhì)地不均一的濾紙常使溶劑擴(kuò)展不一致，隨著纖維的紋理流動(dòng)紊亂，另一方面紙的含水量不均一，也不能得到理想的分離效果。溫度：Rf值的重現(xiàn)性與恒溫情況的好壞有密切關(guān)系。溫度對(duì)Rf值的影響主要是因