動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝課件

17.1.1動物細(xì)胞的一般特征17.1.

2昆蟲表達(dá)系統(tǒng)17.1.

3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)第一節(jié)制藥動物細(xì)胞的表達(dá)與特征動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征17.1.1動物細(xì)胞的一般特征17.1.2昆蟲表達(dá)系統(tǒng)171

沒有細(xì)胞壁細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞器17.1.1動物細(xì)胞的一般特征1、結(jié)構(gòu)與功能動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征沒有細(xì)胞壁17.1.1動物細(xì)胞的一般特征1、結(jié)構(gòu)與功能動2

葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代謝的前提葡萄糖代謝：糖酵解為主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到細(xì)胞外并在培養(yǎng)液中積累；經(jīng)TCA循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生CO2和H2O。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成四、五、七碳糖和NADPH

中間產(chǎn)物進(jìn)入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝葡萄糖代謝旺盛，產(chǎn)生大量的乳酸，對細(xì)胞有毒性葡萄糖限制：增加谷氨酰胺消耗以補償，反之亦然2、細(xì)胞代謝特性—糖代謝動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代謝的前提2、細(xì)胞代謝特性—糖3

谷氨酰胺：脫氨、轉(zhuǎn)氨等，合成其它非必須氨基酸離體動物細(xì)胞，轉(zhuǎn)氨是主要代謝途徑；谷氨酰胺與丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸，進(jìn)入培養(yǎng)液并積累。脫氨產(chǎn)生的氨，對細(xì)胞有毒性。谷氨酰胺是動物細(xì)胞的氮源，受限制時，通過增加其它氨基酸的消耗得以補償。流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整個代謝過程，避免有毒廢物積累。2、細(xì)胞代謝特性—氨基酸代謝動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征谷氨酰胺：脫氨、轉(zhuǎn)氨等，合成其它非必須氨基酸2、細(xì)胞代謝特4

蛋白質(zhì)合成場所：糖基化場所：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成各種糖類，在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)和高爾基體進(jìn)行加工修飾。不同細(xì)胞系糖基化特征不同，選擇適宜細(xì)胞系。對于分泌型蛋白，分泌泡與細(xì)胞膜融合，釋放到胞外，完成了蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。3、蛋白質(zhì)糖基化與分泌表達(dá)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征蛋白質(zhì)合成場所：3、蛋白質(zhì)糖基化與分泌表達(dá)動物細(xì)胞培養(yǎng)動5

昆蟲桿狀病毒如核多角體病毒可攜帶外源基因，感染昆蟲細(xì)胞或幼蟲（宿主），高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)。研究進(jìn)展

1983年，苜蓿尺蠖核多角體病毒—秋黏蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

1984年，家蠶核多角體病毒—家蠶幼蟲表達(dá)系統(tǒng)17.1.

2昆蟲表達(dá)系統(tǒng)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征昆蟲桿狀病毒如核多角體病毒可攜帶外源基因，感染昆蟲細(xì)胞或幼6

安全：桿狀病毒無致病性，產(chǎn)品安全性接受FDA認(rèn)可易飼養(yǎng)：家蠶發(fā)育快、遺傳背景清楚高量表達(dá)：外源基因超量表達(dá)；不連續(xù)且時間短高效表達(dá)：對外源基因有很大的容量（可插入100kb的DNA）可作為重組病毒的選擇性標(biāo)記，是因為外源基因的插入并不影響病毒的增殖，卻喪失合成多角體的能力。翻譯后加工：昆蟲細(xì)胞能進(jìn)行一系列翻譯后的加工，與哺乳動物不同重組率低：篩選困難、周期長，需要4-10d優(yōu)點與不足動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征安全：桿狀病毒無致病性，產(chǎn)品安全性接受FDA認(rèn)可優(yōu)點與不7

重組率低、篩選困難、周期長，需要4-10d

研究開發(fā)的主要方向：有效的病毒表達(dá)系統(tǒng)決定基因表達(dá)時期啟動子，無血清培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征重組率低、篩選困難、周期長，需要4-10d動物細(xì)胞培養(yǎng)動物8

基于細(xì)胞來源：原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞基于細(xì)胞壽命：有限細(xì)胞系、無限細(xì)胞系基于細(xì)胞的染色體數(shù)目：二倍體細(xì)胞系、異倍體細(xì)胞系基于獲得方式：工程細(xì)胞系、癌變細(xì)胞系基于生長特性：貼壁依賴性、非貼壁依賴性1、細(xì)胞系的分類動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征17.1.

3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)基于細(xì)胞來源：原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞1、細(xì)胞系的分類動物細(xì)9

概念：從動物體內(nèi)直接分離得到的細(xì)胞。特點：生長分裂不旺盛，與體內(nèi)細(xì)胞相似應(yīng)用：藥物檢測實驗，藥理研究。生產(chǎn)藥品：雞胚細(xì)胞，兔或鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。1）原代細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征概念：從動物體內(nèi)直接分離得到的細(xì)胞。1）原代細(xì)胞動物細(xì)胞培10

概念：原代細(xì)胞轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的細(xì)胞。特點：細(xì)胞分裂增殖旺盛，二倍體核型。二倍體細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆、純化后，獲得具一定特征的細(xì)胞系。藥品生產(chǎn)：WI－38、MRC－5等。2）傳代細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征概念：原代細(xì)胞轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的細(xì)胞。2）傳代細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)動11

概念：是生長和壽命有限的細(xì)胞，經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后失去增殖能力，老化死亡。特點：有限生長，無致瘤性，有接觸抑制性舉例：WI-38、MRC-5等用于藥品生產(chǎn)，曾經(jīng)廣泛使用壽命：取決于細(xì)胞來源的物種和年齡、器官。人細(xì)胞最高培養(yǎng)次數(shù)50-60代。胚成纖維細(xì)胞：人，50代；雞胚30代；小鼠，8代。3）有限細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征概念：是生長和壽命有限的細(xì)胞，經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后失去增殖能12

概念：是壽命和活性不受傳代次數(shù)影響的細(xì)胞系，可連續(xù)培養(yǎng)特點：沒有接觸抑制性，對培養(yǎng)條件和營養(yǎng)因子要求低，倍增時間短，適合制藥工業(yè)生產(chǎn)理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系4）無限細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征概念：是壽命和活性不受傳代次數(shù)影響的細(xì)胞系，可連續(xù)培養(yǎng)4）13

概念：采用基因工程技術(shù)對宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行了修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨特性狀的細(xì)胞系。方法：正常細(xì)胞異倍體化；融合或重組。5）工程細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征

概念：采用基因工程技術(shù)對宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行了修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨特性狀的細(xì)胞系。方法：正常細(xì)胞異倍體化；融合或重組。5）工程細(xì)胞系概念：采用基因工程技術(shù)對宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行了修飾改造或14

概念：染色體的斷裂變成異倍體，失去了正常細(xì)胞的特點，而獲得了無限增殖的能力。特點：長期培養(yǎng)，倍增時間短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求較低，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。6）轉(zhuǎn)化細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征概念：染色體的斷裂變成異倍體，失去了正常細(xì)胞的特點，而獲得15Namalwa：類淋巴母細(xì)胞，非整倍體，懸浮生長。英國Wellcome公司Sendai病毒誘導(dǎo)，大規(guī)模生產(chǎn)a-干擾素。

WI-38：二倍體成纖維細(xì)胞系，壽命有限。貼壁生長，對許多病毒敏感，第一個被用于制備疫苗

MRC-5：二倍體成纖維細(xì)胞系，生長較WI-38快，對逆境有一定的抗性，用于制備疫苗2、生產(chǎn)用的細(xì)胞系1）人源細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征Namalwa：類淋巴母細(xì)胞，非整倍體，懸浮生長。英國W16CHO細(xì)胞：Chinesehamsterovary

特點：貼壁生長，也可懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的忍耐能力最為普遍和成熟表達(dá)糖基化蛋白質(zhì)藥物的細(xì)胞。多種衍生突變株，高表達(dá)。藥物：tPA、EPO、HBsAg、凝血因子Ⅷ、DNA

酶I等2）哺乳動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征CHO細(xì)胞：Chinesehamsterovary2）17

骨髓瘤細(xì)胞與產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞融合而構(gòu)成的細(xì)胞特點：無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長，容易轉(zhuǎn)染和生長，大量分泌和高效表達(dá)。單克隆抗體的制備。3）雜交瘤細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征骨髓瘤細(xì)胞與產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞融合而構(gòu)成的細(xì)胞3）雜交瘤細(xì)胞18

病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒質(zhì)粒穿梭載體：由質(zhì)粒和表達(dá)篩選盒組成動物細(xì)胞中的篩選功能3、動物細(xì)胞的表達(dá)載體動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒3、動物細(xì)19

對培養(yǎng)條件要求苛刻：無細(xì)胞壁，對周圍環(huán)境十分敏感，理化因素易受傷害對培養(yǎng)基要求高：完全異養(yǎng)，容易利用，相對低分子量的營養(yǎng)物產(chǎn)物：接近天然結(jié)構(gòu)的活性分子，產(chǎn)品與天然的產(chǎn)物一致；有潛在的血源性污染的危險工藝：難度大、產(chǎn)量低、成本高；分離純化簡單4、表達(dá)特點動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞的表達(dá)與特征對培養(yǎng)條件要求苛刻：無細(xì)胞壁，對周圍環(huán)境十分敏感，理化因素20第十七章動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝第一節(jié)制藥動物細(xì)胞的表達(dá)與特征第二節(jié)基因工程動物細(xì)胞系的構(gòu)建第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)基制備第四節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第五節(jié)培養(yǎng)過程檢測與工藝控制第十七章動物細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)制藥動物細(xì)胞的表達(dá)與特征2117.2.1表達(dá)載體的設(shè)計與構(gòu)建17.2.

2轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)17.2.

3篩選與鑒定

第二節(jié)基因工程動物細(xì)胞系的構(gòu)建動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系17.2.1表達(dá)載體的設(shè)計與構(gòu)建17.2.2轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)1722

病毒載體：牛痘病毒：構(gòu)建多價疫苗腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒：基因治療桿狀病毒：外源基因表達(dá)（昆蟲）質(zhì)粒載體：穿梭載體，細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增，在動物細(xì)胞中表達(dá)。1、載體類型17.2.1表達(dá)載體的設(shè)計與構(gòu)建動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系病毒載體：1、載體類型17.2.1表達(dá)載體的設(shè)計與構(gòu)23

基本過程：與基因工程微生物相同區(qū)別：表達(dá)原件，啟動子、終止子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記2、啟動子和復(fù)制子動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系

基本過程：與基因工程微生物相同區(qū)別：表達(dá)原件，啟動子、終止子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記2、啟動子和復(fù)制子

基本過程：與基因工程微生物相同區(qū)別：表達(dá)原件，啟動子、終止子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基本過程：與基因工程微生物相同2、啟動子和復(fù)制子動物24

轉(zhuǎn)錄起始序列和ATG起始密碼ATG的5′端約15bp范圍側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T在-3，-6和-9位置，偏好G堿基在-3，-6和-9位置，整個側(cè)翼序列區(qū)偏好C堿基3、轉(zhuǎn)錄起始序列動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄起始序列和ATG起始密碼3、轉(zhuǎn)錄起始序列動物細(xì)胞254、終止子動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系

終止密碼子：T(U)AA，T(U)AG，T(U)GAPolyA信號序列：不宜太長，避免能量過度消耗常用：SV40PolyA(131)、BGH的PolyA（225bp）終止序列：加尾信號序列AAT(U)AAA或連續(xù)的終止密碼

UGA、UAA和UAG，防止轉(zhuǎn)錄通讀，使轉(zhuǎn)錄在正確位點結(jié)束。增強(qiáng)子：在轉(zhuǎn)錄起始點上游或下游使用，有利于提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。4、終止子4、終止子動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基26

轉(zhuǎn)染指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。

17.2.

2轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系轉(zhuǎn)染指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程27

外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細(xì)胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)

。特點：只持續(xù)幾天17.2.

2轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系1、瞬時轉(zhuǎn)染外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細(xì)胞中28

外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在的表達(dá)

。特點：持續(xù)時間長。17.2.

2轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（29動物細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染方法原

理應(yīng)

用特

點DEAE-葡聚糖法帶正電的DEAE-葡聚糖與帶負(fù)電的核酸磷酸骨架相互作用形成復(fù)合物,通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染相對簡便,結(jié)果可重復(fù),但對細(xì)胞有一定的毒副作用,轉(zhuǎn)染時需去除血清磷酸鈣法磷酸鈣-DNA復(fù)合物吸附于細(xì)胞膜,被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,瞬時轉(zhuǎn)染操作簡便,但重復(fù)性差,不適用于原代細(xì)胞及某些培養(yǎng)細(xì)胞陽離子脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與帶負(fù)電的核酸磷酸骨架形成復(fù)合物,被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時需去除血清，轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法通過感染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞，但攜帶基因不能太大，操作復(fù)雜，耗時。腺病毒介導(dǎo)法通過感染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中瞬時轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜的小孔導(dǎo)入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時轉(zhuǎn)染適用于所有細(xì)胞，但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大?；驑尫▽NA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置射入細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染可用于人的表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞系及原代細(xì)胞顯微注射法通過顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限，多用于基因工程改造動物細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染方法原

理應(yīng)

用特

點DEAE-30

外源基因轉(zhuǎn)染方法：化學(xué)、物理和生物的方法人工脂質(zhì)體法原理：動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系脂質(zhì)體是磷脂分散在水中時形成的脂質(zhì)雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運用脂質(zhì)體模擬生物膜，研究膜的構(gòu)造及功能，從而發(fā)現(xiàn)了膜的融合及內(nèi)吞作用，因而可用作外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體。陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人內(nèi)，形成DNA一脂復(fù)合體，也能被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附，再通過膜的融合或細(xì)胞的內(nèi)吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進(jìn)入細(xì)胞，形成包涵體或進(jìn)入溶酶體，其中一小部分DNA能從包涵體內(nèi)釋放，并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。外源基因轉(zhuǎn)染方法：化學(xué)、物理和生物的方法動物細(xì)胞培養(yǎng)基因31

外源基因轉(zhuǎn)染方法：化學(xué)、物理和生物的方法人工脂質(zhì)體法方法：動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系細(xì)胞制備：105的培養(yǎng)平板，CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)20h。脂質(zhì)體制備：DNA與脂質(zhì)體混勻，室溫下10min。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)：培養(yǎng)基DNA脂質(zhì)體培養(yǎng)6-7h棄去培養(yǎng)基DMSO無血清培養(yǎng)基洗滌2-3次

血清培養(yǎng)基外源基因轉(zhuǎn)染方法：化學(xué)、物理和生物的方法動物細(xì)胞培養(yǎng)基因32

擴(kuò)增培養(yǎng)：非選擇性培養(yǎng)基，1-2d，轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)篩選培養(yǎng)：1:15選擇性培養(yǎng)基，2-4d更換培養(yǎng)基，篩選陽性菌株

2-3周，獲得單克隆細(xì)胞集落鑒定：對獨立集落進(jìn)行穩(wěn)定性、表達(dá)量、生物活性等鑒定。17.2.

3篩選與鑒定動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系動物細(xì)胞培養(yǎng)基因工程動物細(xì)胞系擴(kuò)增培養(yǎng)：非選擇性培養(yǎng)基，1-2d，轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)17.33第十七章動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝第一節(jié)制藥動物細(xì)胞的表達(dá)與特征第二節(jié)基因工程動物細(xì)胞系的構(gòu)建第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)基制備第四節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第五節(jié)培養(yǎng)過程檢測與工藝控制第十七章動物細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)制藥動物細(xì)胞的表達(dá)與特征34動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)基制備17.3.1培養(yǎng)基組成成分17.3.

2培養(yǎng)基種類17.3.

3培養(yǎng)基質(zhì)量控制動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)基制備17.35糖類、必需氨基酸、維生素、無機(jī)鹽類、生長因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)、貼附與伸展因子及其它附加成分等。17.3.1培養(yǎng)基組成成分動物細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求高，不同細(xì)胞系的要求也不盡相同，要盡可能提供與體內(nèi)生活條件接近的培養(yǎng)環(huán)境。動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備糖類、必需氨基酸、維生素、無機(jī)鹽類、生長因子及激素、結(jié)合蛋白36

糖類提供細(xì)胞生長的碳源和能源，分解后釋放出能量ATP。不同細(xì)胞對葡萄糖利用相似，在無氧條件下還產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸。不能利用：多糖、雙糖、寡糖等聚合物。利用：單糖單體化合物。主要是葡萄糖1、糖類動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備糖類提供細(xì)胞生長的碳源和能源，分解后釋放出能量ATP。不37

氮源作用：主要是構(gòu)成含氮化合物不能利用：多肽、蛋白質(zhì)等高分子聚合物。利用：氨基酸等單體化合物。

12種是必需氨基酸：Arg、Cys、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、Val。必須在培養(yǎng)基中添加，才能滿足細(xì)胞的生長2、氨基酸動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備氮源作用：主要是構(gòu)成含氮化合物2、氨基酸動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞38

作用：一類微量的小分子有機(jī)物，既不是細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)，也不是能量物質(zhì)，但對代謝和生長起調(diào)節(jié)和控制作用。水溶性維生素：B族維生素和維生素C

脂溶性維生素：維生素A、D、E、K四種。3、維生素動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備作用：一類微量的小分子有機(jī)物，既不是細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)，也不是39

作用：細(xì)胞代謝所需酶的輔基，調(diào)節(jié)酶活性，細(xì)胞構(gòu)成成分參與生理活動。維持水平衡、保持滲透壓和酸堿平衡。胞外無機(jī)鹽對維持正常生長環(huán)境很重要。4、無機(jī)鹽類動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備作用：細(xì)胞代謝所需酶的輔基，調(diào)節(jié)酶活性，細(xì)胞構(gòu)成成分4、無40

激素：調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長（刺激作用），胰島素。貼附因子：細(xì)胞的貼壁生長必需，如膠原。脂類化合物：不飽和脂肪酸，如亞油酸、固醇等。載體蛋白：鐵離子。5、激素與附加成分動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備激素：調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長（刺激作用），胰島素。5、激素與附加成4117.3.

2培養(yǎng)基種類

天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備17.3.2培養(yǎng)基種類天然培養(yǎng)基動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制42

概念：直接取自于動物組織提取液或體液作為培養(yǎng)基種類：血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液特點：營養(yǎng)價值高，許多細(xì)胞系和原代及傳代培養(yǎng)缺點：成分復(fù)雜，不穩(wěn)定，來源受到限制，不宜大量生產(chǎn)使用。具有血源性污染的可能性，病毒、支原體污染分離純化：增加難度。增加成本：工業(yè)化生產(chǎn)使用受限。1、天然培養(yǎng)基動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備概念：直接取自于動物組織提取液或體液作為培養(yǎng)基1、天然培養(yǎng)43

概念：用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基。組成：糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素及其他成分。特點：組分穩(wěn)定，容易配制。缺點：培養(yǎng)基中須添加5％-20％血清，才能培養(yǎng)。已有幾十種合成培養(yǎng)基，大部分已商品化。如MEM、BME、DMEM、IMEM、HAMF12、PRMI1640、M1992、合成培養(yǎng)基動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備概念：用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基。2、合成培養(yǎng)基動44血清成分與作用

含有基本的營養(yǎng)成分：補充合成培養(yǎng)基成分的不足脂肪酸和微量元素：細(xì)胞生長所必需，磷脂質(zhì)、膽固醇、前列腺素E，銅、鋅、鈷、鉬、硒。激素和生長因子：細(xì)胞增殖、分化，胰島素、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、皮質(zhì)醇、雌二醇。貼附和伸展因子：細(xì)胞貼壁所需，纖維結(jié)合蛋白、軟骨素、膠原等。載體蛋白：白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白，金屬、激素、維生素和脂類結(jié)合，帶入細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備血清成分與作用含有基本的營養(yǎng)成分：補充合成培養(yǎng)基成分的不45血清成分與作用

蛋白酶抑制劑：降解細(xì)胞死亡釋放的蛋白質(zhì)；消除毒素和金屬的毒性。蛋白質(zhì)：抗機(jī)械剪切，保護(hù)細(xì)胞免于損傷的作用緩沖物質(zhì)：K、Na、Cl、Fe、Ca、葡萄糖等，穩(wěn)定pH和滲透壓來源：胎牛血清、新生?；虺膳Ｑ?、馬血清、雞血清、羊血清及人血清。應(yīng)用于許多細(xì)胞系和原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備血清成分與作用蛋白酶抑制劑：降解細(xì)胞死亡釋放的蛋白質(zhì)；消46

概念：不添加血清、使細(xì)胞能在體外生長繁殖的的合成培養(yǎng)基。組成：合成培養(yǎng)基基礎(chǔ)之上，添加激素與生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁與伸展因子、低分子量營養(yǎng)因子。特點：提高了培養(yǎng)的質(zhì)量，避免血清帶來的麻煩，產(chǎn)品純化容易，組分穩(wěn)定，大量配制。商品化的培養(yǎng)基：3、無血清培養(yǎng)基動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備概念：不添加血清、使細(xì)胞能在體外生長繁殖的的合成培養(yǎng)基。34717.3.

3培養(yǎng)基質(zhì)量控制

培養(yǎng)用水質(zhì)緩沖液生理鹽水和平衡鹽溶液其他成分配制動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備17.3.3培養(yǎng)基質(zhì)量控制培養(yǎng)用水質(zhì)動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)48

必需使用純凈水配制培養(yǎng)基水存放時間不宜超過2周普通水必需除去各類元素、有毒或有害物質(zhì)及微生物和熱源，達(dá)到純凈水標(biāo)準(zhǔn)。1、培養(yǎng)用水質(zhì)動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備必需使用純凈水配制培養(yǎng)基1、培養(yǎng)用水質(zhì)動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)49

弱酸與弱酸鹽：碳酸氫鈉/碳酸體系弱堿與弱堿鹽：磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉體系作用：pH恒定。2、緩沖液動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備弱酸與弱酸鹽：碳酸氫鈉/碳酸體系2、緩沖液動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)50

生理鹽水：調(diào)節(jié)滲透壓的鹽溶液，0.9%NaCl等滲能力平衡鹽溶液：BSS

由生理鹽水，緩沖劑與指示劑、無機(jī)鹽、葡萄糖等成分。作用：滿足細(xì)胞對鹽離子營養(yǎng)的要求；pH和滲透壓的環(huán)境要求；直觀觀察pH。加入酚紅指示劑，酸性黃色、中性櫻桃紅、堿性紫紅色。3、生理鹽水和平衡鹽溶液動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備生理鹽水：調(diào)節(jié)滲透壓的鹽溶液，0.9%NaCl等滲能力351

用量：使用L-型氨基酸，對于DL-混合型氨基酸，使用量應(yīng)該加倍。谷氨酰胺很不穩(wěn)定：單獨配制溶液。

Gln濃度：100倍濃縮液，－20℃保存一般培養(yǎng)液中含量為1～4mmol/L。4、氨基酸的配制動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備用量：使用L-型氨基酸，對于DL-混合型氨基酸，使用量應(yīng)該52

不含葡萄糖的溶液常規(guī)高壓滅菌。含葡萄糖時，采用過濾除菌；或115℃，15min

血清使用：需要滅活（56℃，30min），過濾滅菌，按一定比例加入。4℃保存。出現(xiàn)沉淀、混濁時，要重新配制。5、培養(yǎng)基的滅菌動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基制備不含葡萄糖的溶液常規(guī)高壓滅菌。5、培養(yǎng)基的滅菌動物細(xì)胞培53第十七章動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝第一節(jié)制藥動物細(xì)胞的表達(dá)與特征第二節(jié)基因工程動物細(xì)胞系的構(gòu)建第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)基制備第四節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第五節(jié)培養(yǎng)過程檢測與工藝控制第十七章動物細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)制藥動物細(xì)胞的表達(dá)與特征54動物細(xì)胞培養(yǎng)第四節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)17.4.1動物細(xì)胞生長和基質(zhì)依賴性17.4.

2動物細(xì)胞培養(yǎng)基本過程17.4.

3動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法17.4.

4動物細(xì)胞培養(yǎng)操作方式動物細(xì)胞培養(yǎng)第四節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)17.55動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)17.4.1動物細(xì)胞生長和基質(zhì)依賴性

生長基質(zhì)接觸抑制貼壁依賴性細(xì)胞非貼壁依賴性細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)17.4.1動物細(xì)胞生長和基質(zhì)依56

概念：改變介質(zhì)表面特性，促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì)。作用：為介質(zhì)表面提供適量帶電荷，細(xì)胞被吸附在介質(zhì)上，實現(xiàn)貼壁生長。原理：細(xì)胞、玻璃和塑料介質(zhì)表面帶負(fù)電荷；要使細(xì)胞貼壁，必須進(jìn)行二價陽離子、糖蛋白或其它試劑交聯(lián)，使之表面帶正電荷。天然生長介質(zhì)：胞外基質(zhì)成分，膠原。人工生長介質(zhì)：多聚賴氨酸1、生長基質(zhì)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概念：改變介質(zhì)表面特性，促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì)。1、生長基質(zhì)57

概念：細(xì)胞在生長基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯集成片，當(dāng)每個細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞互相接觸時，細(xì)胞就停止增殖。特點：保持充足的營養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時間，但細(xì)胞密度不再增加。有：大多數(shù)細(xì)胞無：少數(shù)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（癌細(xì)胞）2、接觸抑制培養(yǎng)基中的生長因子耗盡時也會產(chǎn)生生長抑制，所以將正常細(xì)胞因相互接觸而抑制分裂的現(xiàn)象改稱為密度依賴性的生長抑制。細(xì)胞膜上有糖類和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的糖蛋白，也叫做糖被，他在細(xì)胞上起識別作用。當(dāng)細(xì)胞增殖到一定程度，也就是互相挨在一起的時候，糖蛋白識別了這種信息，就會使細(xì)胞停止繼續(xù)繁殖，這種現(xiàn)象就叫做接觸抑制。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概念：細(xì)胞在生長基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯集成片，當(dāng)每個2、58

概念：生長需要在適量帶電荷的固體或半固體支持表面，細(xì)胞自身分泌或人為在培養(yǎng)基中加入貼附因子，使細(xì)胞依附在支持物表面，才能生長和增殖。大多數(shù)動物細(xì)胞都屬于此類，細(xì)胞對培養(yǎng)用器皿的附著能力的不同就是細(xì)胞貼壁性能代表了細(xì)胞的活力。3、貼壁依賴性細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概念：生長需要在適量帶電荷的固體或半固體支持表面，細(xì)胞自身594、非貼壁依賴性細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)4、非貼壁依賴性細(xì)胞

概念：生長不依賴于固體支持物表面，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，有時被稱為懸浮細(xì)胞。血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞屬于此類，生長干擾素的Namalwa細(xì)胞。4、非貼壁依賴性細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)4、非貼壁60

概念：對支持物的依賴性不嚴(yán)格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。如：CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞。理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系5、兼性貼壁依賴性細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概念：對支持物的依賴性不嚴(yán)格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。6117.4.

2動物細(xì)胞培養(yǎng)基本過程

原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞系的保存與復(fù)蘇動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)17.4.2動物細(xì)胞培養(yǎng)基本過程原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)動物細(xì)621、原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離心或過濾培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞洗滌接種培養(yǎng)

從體內(nèi)取出組織或器官經(jīng)過粉碎、消化而獲得單細(xì)胞進(jìn)行體外接種培養(yǎng)。

37℃消化，胰蛋白酶，膠原酶消化液濃度：0.1-0.3mg/ml動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1、原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離63動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)64動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)65動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)66動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)67動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)68動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)692、傳代培養(yǎng)--過程

概念：對長滿表面的細(xì)胞進(jìn)行消化分離，接種到新的培養(yǎng)基上，進(jìn)行新一輪培養(yǎng)。傳代時期：剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞。過早產(chǎn)量低，過晚健康狀態(tài)不佳。消化方法：過程與原代細(xì)胞相同。用30－50倍體積的0.25％胰蛋白酶和EDTA對細(xì)胞塊消化，消化后再培養(yǎng)。要注意消化程度，細(xì)胞對酶的反應(yīng)不同，有的敏感，掌握好適宜的消化時間和方法，不要過度，獲得細(xì)胞濃度均勻，生長速度一致的傳代細(xì)胞。防止細(xì)胞系之間、非細(xì)胞生物的污染。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2、傳代培養(yǎng)--過程概念：對長滿表面的細(xì)胞進(jìn)行消化分離，703、細(xì)胞系的建立動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一旦獲得了穩(wěn)定的有一定特性的細(xì)胞系，就建立細(xì)胞庫，進(jìn)行長期保存。根據(jù)藥品生產(chǎn)的有關(guān)規(guī)定，必須建立原始細(xì)胞庫和生產(chǎn)用細(xì)胞庫或工作細(xì)胞庫。WCB1QCWCB2QCQC原始培養(yǎng)物MCBQC內(nèi)容：細(xì)胞活性檢測、無菌實驗、核型、DNA分析、同工酶分析、支原體試驗、其他外源物試驗、穩(wěn)定性和基因型分析等，工作細(xì)胞庫必須與主細(xì)胞庫完全一致。3、細(xì)胞系的建立動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一旦獲得了穩(wěn)定714、細(xì)胞系的凍存與復(fù)蘇動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

概念：細(xì)胞混懸于凍存液中，以一定的速度將細(xì)胞懸液降至-70℃以下，常于液氮下保存。冷凍保護(hù)液：含10％血清的培養(yǎng)液，附加10％甘油或10%DMSO，降低冰點，減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，減少在凍存過程中對細(xì)胞的損傷。方法：

選用指數(shù)期細(xì)胞；貼壁細(xì)胞須消化，制備成單細(xì)胞懸液，離心，制成106/ml；分裝至保存管中，注明細(xì)胞名稱和日期；降溫：冷凍速度-1℃/min，當(dāng)溫度降至-25℃時，可加速冷凍。4、細(xì)胞系的凍存與復(fù)蘇動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概念：724、細(xì)胞系的凍存與復(fù)蘇

概念：以一定的復(fù)溫速度將凍存細(xì)胞恢復(fù)至常溫。方法：取出凍存管，立即放置于37～40℃水浴中，快速融化，應(yīng)在1min內(nèi)完成；在保護(hù)劑存在下，慢凍快融是保存復(fù)蘇細(xì)胞的要領(lǐng)。必須要帶護(hù)目鏡和手套。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)4、細(xì)胞系的凍存與復(fù)蘇概念：以一定的復(fù)溫速度將凍存細(xì)胞恢7317.4.

3動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法

單層貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)微囊培養(yǎng)微載體培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)17.4.3動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法單層貼壁培養(yǎng)動物細(xì)胞培741、單層貼壁培養(yǎng)

概念：細(xì)胞貼附于一定的固體支持表面上，形成單層細(xì)胞的培養(yǎng)方法。大多數(shù)動物細(xì)胞屬于貼壁依賴性，貼壁培養(yǎng)是動物細(xì)胞培養(yǎng)的一種重要方法。生長過程：接種，細(xì)胞經(jīng)過吸附、接觸而貼附于基質(zhì)表面；進(jìn)行生長、分裂繁殖，很快進(jìn)入對數(shù)期。數(shù)天就長滿整個表面，形成致密單層細(xì)胞。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1、單層貼壁培養(yǎng)概念：細(xì)胞貼附于一定的固體支持表面上，形成75單層貼壁培養(yǎng)—特點

培養(yǎng)容器：轉(zhuǎn)瓶、玻璃珠、微載體和中空纖維等。滾瓶是為早期培養(yǎng)所采用，結(jié)構(gòu)簡單，投資少，重復(fù)性好。優(yōu)點：容易更換培養(yǎng)液，灌注培養(yǎng)時，能達(dá)到高細(xì)胞密度；有利于產(chǎn)物的分泌表達(dá)，可改變培養(yǎng)液與細(xì)胞的比例。缺點：操作較繁雜勞動強(qiáng)度大檢測受到限制培養(yǎng)條件難以均一傳質(zhì)和傳氧差占用空間大，產(chǎn)量低，放大培養(yǎng)是瓶頸。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單層貼壁培養(yǎng)—特點培養(yǎng)容器：轉(zhuǎn)瓶、玻璃珠、微載體和中空762、懸浮培養(yǎng)

概念：細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮在培養(yǎng)液中生長的培養(yǎng)過程。優(yōu)點：操作簡單，培養(yǎng)條件相對均一傳質(zhì)和傳氧較好，容易放大培養(yǎng)。缺點：細(xì)胞體積小密度低培養(yǎng)病毒易失去標(biāo)記而降低免疫能力。適用范圍：懸浮細(xì)胞，兼性貼壁細(xì)胞，雜交瘤。借鑒微生物發(fā)酵理論和經(jīng)驗，發(fā)揮動物細(xì)胞的特性。培養(yǎng)容器：通氣式攪拌和氣升式生物反應(yīng)器動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2、懸浮培養(yǎng)概念：細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮在培養(yǎng)液中生長的773、微囊培養(yǎng)

微囊培養(yǎng)：在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物質(zhì)及生長介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。適用于貼壁和非貼壁培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1.4%海藻酸鈉溶液多聚賴氨酸攪拌式或氣升式反應(yīng)器系統(tǒng)3、微囊培養(yǎng)微囊培養(yǎng)：在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物783、微囊培養(yǎng)

微囊法：親水半透膜把細(xì)胞包埋在微囊內(nèi)。培養(yǎng)結(jié)束后，收獲微囊，破微囊，純化抗體，純化工藝簡單，應(yīng)用前景廣。多聚賴氨酸/海藻酸固定細(xì)胞：凝膠載體的表面被多聚賴氨酸覆蓋，形成一層多孔可透薄膜，再使凝膠載體液化，便可制成微囊產(chǎn)品的純度高。雜交瘤細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合，經(jīng)微囊發(fā)生器，微球滴入氯化鈣溶液中，形成凝膠，然后用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，再用檸檬酸去鈣離子，球內(nèi)海藻酸鈉成液態(tài)，細(xì)胞在在微囊內(nèi)懸浮。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)3、微囊培養(yǎng)微囊法：親水半透膜把細(xì)胞包埋在微囊內(nèi)。動物793、微囊培養(yǎng)

微囊法優(yōu)點：可防止細(xì)胞在培養(yǎng)過程中受到物理損傷能從囊中自由出入半透膜，從而提高細(xì)胞密度和產(chǎn)物含量，并方便分離純化處理。缺點:

微囊制作復(fù)雜,成功率不高微囊內(nèi)死亡的細(xì)胞會污染正常產(chǎn)物收集產(chǎn)物必須破壁,不能實現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化

動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)3、微囊培養(yǎng)微囊法優(yōu)點：動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)804、微載體培養(yǎng)

微載體：是指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長的微珠。特點：微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內(nèi)表面積，對細(xì)胞的生長非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100-200μm之間。微載體的密度：一般為1.03-1.05g/cm2，隨著細(xì)胞的貼附及生長，密度可逐漸增大。微載體的表面電荷：據(jù)研究，控制細(xì)胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會產(chǎn)生“毒性”效應(yīng)。

微載體動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)4、微載體培養(yǎng)微載體：是指直徑在60-250μm，能適用81微載體培養(yǎng)

概念：細(xì)胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培養(yǎng)液中的培養(yǎng)過程。優(yōu)點：細(xì)胞生長的環(huán)境均一培養(yǎng)基利用率高重復(fù)性好減少了勞動強(qiáng)度，容易放大。兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點種類：微載體，多孔微載體。應(yīng)用：工業(yè)化生產(chǎn)干擾素、疫苗和尿激酶原。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)微載體培養(yǎng)概念：細(xì)胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培82原理：是將對細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長和擴(kuò)展成單層三個階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長的關(guān)鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細(xì)胞能否在微載體表面黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。

原理動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原理：是將對細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，83微載體培養(yǎng)操作要點

培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的pH與溫度水平，接種細(xì)胞至終體積1/3的培養(yǎng)液中。貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。培養(yǎng)維持期：進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)、葡萄糖測定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨著細(xì)胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重新開始攪拌。

收獲細(xì)胞：微載體培養(yǎng)的放大：動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)微載體培養(yǎng)操作要點培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的84微載體培養(yǎng)操作要點

培養(yǎng)初期貼壁階段培養(yǎng)維持期：收獲細(xì)胞：排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應(yīng)的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然后解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。

微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行

動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)微載體培養(yǎng)操作要點培養(yǎng)初期動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)851、分批式操作

已用于攪拌式反應(yīng)器或氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，生產(chǎn)單克隆抗體。分批培養(yǎng)雜交瘤和骨髓瘤細(xì)胞的周期為3～5天，細(xì)胞密度達(dá)2～5×105/ml。單克隆抗體的產(chǎn)量約10～100mg/L。在大規(guī)模攪拌反應(yīng)器中，細(xì)胞密度較低，最終達(dá)5×106，而在750～1500cm2的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)中，細(xì)胞密度達(dá)1～2×108。17.4.

4動物細(xì)胞培養(yǎng)操作方式動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1、分批式操作已用于攪拌式反應(yīng)器或氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)862、流加式操作

最常見的流加物質(zhì)是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物質(zhì)。通過流加控制，可實現(xiàn)高密度培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞密度可達(dá)1.4×107，生產(chǎn)抗體的產(chǎn)量比分批操作提高幾～10倍，可達(dá)500mg/L。由于培養(yǎng)體積不斷變化，流加對過程的控制能力仍然有限在實際生產(chǎn)中應(yīng)用少。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2、流加式操作最常見的流加物質(zhì)是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和873、半連續(xù)式操作

動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常采用。已應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)乙肝表面抗原、t-PA等基因工程產(chǎn)物。半連續(xù)操作特別適用于分泌表達(dá)型細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，尤其是微載體系統(tǒng)。微載體系統(tǒng)培養(yǎng)基因工程CHO細(xì)胞，待細(xì)胞長滿載體后，反復(fù)收獲細(xì)胞的分泌產(chǎn)物乙肝表面抗原，制備乙肝疫苗。該方式操作簡單，使細(xì)胞密度和產(chǎn)量維持在較高水平，能在較長時間內(nèi)進(jìn)行持續(xù)生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)物，生產(chǎn)效率高，是動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常被采用的方式。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)3、半連續(xù)式操作動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常采用。已應(yīng)用于大884、罐流操作

概念：是一種細(xì)胞被截留在反應(yīng)器內(nèi)的連續(xù)操作方式。在培養(yǎng)后期不斷的加入新鮮培養(yǎng)基，同時以同樣的流量排出部分培養(yǎng)基，借助于出口介質(zhì)過濾把細(xì)胞滯留在反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)方式。是最受推崇的用動物細(xì)胞生產(chǎn)藥物的方式。罐流體系的分類全部截留:100％截留細(xì)胞，如固定化包埋細(xì)胞，可通過中空纖維、平板膜、凝膠顆粒和微囊等實現(xiàn)；部分截留:使用微載體系統(tǒng)、貼壁系統(tǒng)、分離懸浮系統(tǒng)等實現(xiàn)。流化床包埋培養(yǎng)人鼠雜交瘤細(xì)胞，整個反應(yīng)器有效濃度達(dá)4×108/ml，單位體積產(chǎn)量提高200～300倍。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)4、罐流操作概念：是一種細(xì)胞被截留在反應(yīng)器內(nèi)的連續(xù)操作方894、罐流操作

優(yōu)點：全部截留

大大提高了細(xì)胞生長密度和產(chǎn)物濃度。利用培養(yǎng)基，降低細(xì)胞代謝廢物，細(xì)胞生長良好。產(chǎn)物為分泌蛋白質(zhì)，滯留時間短，避免了產(chǎn)物的聚合、降解等產(chǎn)量和活性形式的變化，有利于純化。中空纖維生物反應(yīng)器、固定床或流化床反應(yīng)器、膜生物反應(yīng)器等的唯一可操作方式。缺點：要求復(fù)雜儀器設(shè)備控制灌流操作過程，由于過濾器容易堵塞，從而限制培養(yǎng)次數(shù)。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)4、罐流操作優(yōu)點：動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)902、罐流操作優(yōu)缺點

提高細(xì)胞培養(yǎng)密度，和產(chǎn)物濃度?？煽刂婆囵B(yǎng)液處于低廢物的水平，細(xì)胞生長好，延長培養(yǎng)周期。產(chǎn)物為分泌蛋白質(zhì)，滯留時間短，避免了產(chǎn)物的聚合、降解等產(chǎn)量和活性形式的變化，有利于純化。缺點：要求復(fù)雜儀器設(shè)備控制灌流操作過程，由于過濾器容易堵塞，從而限制培養(yǎng)次數(shù)。動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2、罐流操作優(yōu)缺點提高細(xì)胞培養(yǎng)密度，和產(chǎn)物濃度。動物細(xì)胞91第十七章動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝第一節(jié)制藥動物細(xì)胞的表達(dá)與特征第二節(jié)基因工程動物細(xì)胞系的構(gòu)建第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)基制備第四節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第五節(jié)培養(yǎng)過程檢測與工藝控制第十七章動物細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)制藥動物細(xì)胞的表達(dá)與特征92

生長環(huán)境參數(shù)：溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速、液流量培養(yǎng)基成分變化參數(shù)：葡萄糖消耗率、乳酸生成率、銨離子濃度生長狀態(tài)參數(shù)：形態(tài)變化、活性高低、密度大小目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)率：產(chǎn)物合成與積累速度，分泌微生物的污染參數(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)過程檢測與工藝生長環(huán)境參數(shù)：溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速、液流量動物細(xì)胞培養(yǎng)過9317.5.1細(xì)胞活性與形態(tài)檢測

17.5.

2微生物污染的檢測與防止17.5.

3培養(yǎng)基成分的檢測與代謝控制第五節(jié)培養(yǎng)過程檢測與工藝控制17.5.4攪拌剪切的檢測與控制動物細(xì)胞培養(yǎng)過程檢測與工藝17.5.1細(xì)胞活性與形態(tài)檢測17.5.2微生物污染的檢941、細(xì)胞數(shù)目與活性的檢測動物細(xì)胞培養(yǎng)過程檢測與工藝17.5.1細(xì)胞活性與形態(tài)檢測

離線分析：血細(xì)胞計數(shù)板或分光光度計，確定反應(yīng)器中的細(xì)胞數(shù)目。

在線分析：近紅外線傳感器，可把細(xì)胞計數(shù)和活性控制結(jié)合在一起細(xì)胞活性：組織化學(xué)染色法和細(xì)胞形態(tài)的觀察檢測細(xì)胞活性。臺盼籃染色排除法，MTT比色分析1、細(xì)胞數(shù)目與活性的檢測動物細(xì)胞培養(yǎng)過程檢測與工藝17.5.952、細(xì)胞凋亡

概念：細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，受內(nèi)在遺傳機(jī)制的控制自動結(jié)束生命的過程。凋亡細(xì)胞排斥活體染料，臺盼籃不能檢測。光學(xué)顯微鏡：直接形態(tài)觀察凋亡小體熒光顯微鏡：熒光染料染色，觀察細(xì)胞核的形態(tài)動物細(xì)胞培養(yǎng)過程檢測與工藝細(xì)胞死亡有兩種形式，即凋亡和壞死，其形態(tài)學(xué)和生化變化完全不同。壞死：細(xì)胞受到嚴(yán)重傷害時快速膨脹，染色質(zhì)凝聚，而死亡，細(xì)胞直接裂解，壞死過程不受細(xì)胞自主控制。2、細(xì)胞凋亡概念：細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理條件96

細(xì)菌污染：肉湯培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)，檢查。支原體污染：染色、培養(yǎng)和共培養(yǎng)，至少同時使用兩種方法。使用抗生素、卡那霉素、金霉素處理培養(yǎng)物。特異性的支原體血清、高溫、支原體去除劑。高溫處理，支原體和細(xì)胞的耐熱性不同，支原體敏感。17.5.

2微生物污染的檢測與防止動物細(xì)胞培養(yǎng)過程檢測與工藝細(xì)菌污染：肉湯培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)，檢查。17.5.297

營養(yǎng)的消耗：葡萄糖和谷氨酰胺的減少為指標(biāo)副產(chǎn)物的積累：乳酸和銨離子的增加近紅外測量技術(shù)可實現(xiàn)葡萄糖的在線檢測控制銨離子濃度低于2-4mmol/L。乳酸低于60mmol/L17.