考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白濃度

Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是:（1） 靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)一染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。（2） 測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3） 干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是：（1） 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g一球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2） 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。（3） 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。（二）試劑與器材1.試劑：（1） 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用g一球蛋白或牛血清清蛋白（BSA），配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2） 考馬斯亮蘭G—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀釋至1升。2,器材:（1）可見光分光光度計(jì)（2） 旋渦混合器（3） 試管16支（三）操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)方法（1） 取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G-250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。（2） 加完試劑2~5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡?？捡R斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)表格：管號(hào)12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)00.010.020.040.060.080.10（1.0mg/ml）未知蛋白質(zhì)0.020.040.06（約1.0mg/ml）蒸餾水0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋白質(zhì)量（mg）光吸收值(A595)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(mg)為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)一染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g一球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣)。標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。(二)試劑與器材1.試劑:（1） 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用g一球蛋白或牛血清清蛋白（BSA），配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2） 考馬斯亮蘭G—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀釋至1升。2,器材：（1） 可見光分光光度計(jì)（2） 旋渦混合器（3） 試管16支（三）操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)方法（1） 取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。（2） 加完試劑2~5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡。考馬斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)表格：管號(hào)12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)00.010.020.040.060.080.10（1.0mg/ml）未知蛋白質(zhì)0.020.040.06蒸餾水0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5.05.05.05.05.05.0