項目的意義必要性和依據(jù)近年來大量的研究證實間充質(zhì)干細(xì)胞

（一）項目的意義、必要性和根據(jù)近年來大量的研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是骨髓微環(huán)境細(xì)胞的來源細(xì)胞，是來源于發(fā)育初期中胚層和外胚層的一類多能干細(xì)胞。MSCs因其具有如下特點而日益受到人們的關(guān)注：(1)多向分化潛能：在體內(nèi)/外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞；(2)造血支持和促植入：作為造血微環(huán)境重要細(xì)胞成分——基質(zhì)細(xì)胞系的干細(xì)胞，MSCs通過細(xì)胞對細(xì)胞的直接作用、分泌細(xì)胞外基質(zhì)及多種細(xì)胞因子，實現(xiàn)對造血的精細(xì)調(diào)控，支持造血干細(xì)胞的生長，與造血干細(xì)胞共同移植可增進(jìn)造血干細(xì)胞的植入；(3)免疫調(diào)控：MSCs體現(xiàn)MHC-I類分子，不體現(xiàn)CD80，CD86，HLA-DR等協(xié)同刺激分子，體外可克制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受，對于防止和治療異基因造血細(xì)胞移植后引起的移植物抗宿主病，誘導(dǎo)器官移植免疫耐受有很好的應(yīng)用前景。(4)自我復(fù)制：MSCs作為干細(xì)胞可以自我復(fù)制，體外擴(kuò)增、增殖能力強(qiáng)，可以作為基因操作的干細(xì)胞平臺，在基因治療中有著十分誘人的前景。在造血干細(xì)胞移植治療惡性血液病的應(yīng)用研究增進(jìn)造血干細(xì)胞移植的造血重建：近年來有關(guān)MSCs體內(nèi)、外支持造血，克制免疫功能的報道有諸多，提醒MSCs可以作為造血干細(xì)胞移植的共移植手段以及應(yīng)用于臨床有關(guān)疾病的治療，可提高造血干細(xì)胞移植患者的存活率和移植后生存質(zhì)量，從而大大提高移植治療的有效性和適應(yīng)癥，具有良好的應(yīng)用前景。MSCs經(jīng)靜脈回輸后廣泛分布于骨髓、肝臟、脾、胃腸道、腎臟、肺臟及肌肉等器官組織，對受體BM-MSCs來源的檢測成果發(fā)現(xiàn)，供體來源的MSCs可以定植于受體骨髓。Maitra等體外擴(kuò)增人MSCs，與造血干細(xì)胞（HSC）共移植給NOD/SCID小鼠，對照研究成果顯示，當(dāng)HSC數(shù)量有限時，只有同步予以MSCs輸注才能獲得更為有效的造血植入。黃紹良等進(jìn)行了自體和異基因MSCs聯(lián)合臍血移植的I期臨床試驗，成果顯示異基因MSCs聯(lián)合UD-UCBT具有明顯增進(jìn)造血恢復(fù)的作用。Lazarus等對MSCs自體輸注進(jìn)行了I期臨床試驗，從23例造血系統(tǒng)腫瘤包括急性髓細(xì)胞白血病(AML)、急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤緩和期患者中分別抽取骨髓10ml-15ml，體外培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs，15例患者經(jīng)2-3次傳代后給與3個劑量組進(jìn)行回輸，各劑量組均未發(fā)生輸注有關(guān)毒性反應(yīng)。Koc等對28例晚期乳腺癌患者施行高劑量清髓性化療，然后輸注外周血動員的自體干細(xì)胞和經(jīng)體外擴(kuò)增的自體MSCs；所有患者也均未發(fā)生輸注有關(guān)反應(yīng)，并且造血功能迅速恢復(fù)。Lee等聯(lián)合應(yīng)用HLA半相合的親緣外周血動員干細(xì)胞及其體外擴(kuò)增的MSCs移植對1例高危AML女性患者進(jìn)行治療后,該患者造血功能迅速恢復(fù),急、慢性GVHD均未發(fā)生，隨訪至移植后31個月時仍保持完全緩和。聯(lián)合HSCs和間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行移植確實可以增進(jìn)移植后造血功能的恢復(fù)，其移植成功率明顯高于單純的HSCT。間充質(zhì)干細(xì)胞增進(jìn)HSCs歸巢、定植、增殖并不依賴于對骨髓造血微環(huán)境的修復(fù)，而與其產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子如SDF一1、TGF一81、MIP一1a及MCP一1等有關(guān)。間充質(zhì)干細(xì)胞不僅可以增進(jìn)造血功能恢復(fù)、減少移植后并發(fā)癥的發(fā)生率和死亡率，并且沒有明顯的毒副作用，提醒間充質(zhì)干細(xì)胞移植是一種安全、可行的措施。對移植物抗宿主?。℅VHD）的防治作用：同種異基因HSCs移植是也許治愈多種惡性血液病的唯一措施，不過GVHD的發(fā)生卻大大減少了移植的成功率，GVHD是引起異基因HSCT后患者死亡的重要原因之一。研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有克制T細(xì)胞激活、增殖的功能，可以用以GVHD的防治。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生GVHD時患者促炎因子分泌增長，樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞被激活引起組織損傷。體外試驗表明MSCs可以和多種免疫細(xì)胞互相作用，以變化其免疫功能。MSCs不僅具有免疫逃避能力，并且具有克制排斥反應(yīng)的功能。MSCs可以克制幼稚性和記憶性T淋巴細(xì)胞，阻抑T淋巴細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞(APCs)接觸，通過APCs間接的克制T淋巴細(xì)胞。盡管MSCs發(fā)揮免疫調(diào)整功能的機(jī)制尚不清晰，但其對GVHD的防治潛能是可以確定的。MSCs具有良好的免疫耐受性，可以逃避受者的免疫識別，對T淋巴細(xì)胞的克制作用和其供者來源沒有明顯的關(guān)系。近來Ringden等人應(yīng)用異基因間充質(zhì)干細(xì)胞治療類固醇耐藥的GVHD患者療效明顯。8例病人中有6例急性GVHD完全明顯，并且沒有MSCs治療的急性副反應(yīng)出現(xiàn)。他們得出結(jié)論認(rèn)為對于異基因MSCs治療GVHD來說，無論是HLA配型相合，半相合還是完全HLA不匹配供者來源的MSCs都合用，并且可以很好的修復(fù)GVHD所致的腸道上皮損傷。因此可以選用MHC不相匹配的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行移植以提高移植效率，克制GVHD。總之，聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞和HSCs進(jìn)行移植可以提高移植效率，減少GVHD的發(fā)生率，并且是一種安全、無直接和后期毒性的治療措施。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用研究干細(xì)胞具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能是神經(jīng)科學(xué)研究的重要進(jìn)展，給許多此前認(rèn)為是不治之癥的神經(jīng)損傷性疾病(如脊髓損傷、腦損傷、外周神經(jīng)損傷等)的治療帶來了新但愿。在脊髓損傷中的研究：脊髓損傷后形成瘢痕組織阻礙神經(jīng)元的再生下行、神經(jīng)纖維的變性壞死以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)克制神經(jīng)元再生的微環(huán)境等原因，阻礙了脊髓損傷的恢復(fù)。骨髓MSCs的發(fā)現(xiàn)、分離與成功誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，為脊髓損傷的移植治療提供了“種子細(xì)胞”，其移植也許成為一種保護(hù)和增進(jìn)損傷的脊髓功能恢復(fù)的嶄新治療手段。Ankeny等將MSCs種植脊髓損傷的大鼠模型中，成果發(fā)現(xiàn)，移植組大鼠后腿空中蹬腿動作以及步態(tài)循環(huán)控制能力恢復(fù)，MSCs移植物充斥病變腔隙，并伴隨有宿主組織和白質(zhì)(髓鞘)的保留，證明具有神經(jīng)保護(hù)作用；與對照組相比，移植組能更有效地增進(jìn)軸索生長；此外，MSCs中的大部分神經(jīng)纖維生長方向與脊髓的長軸索平行，提醒其可直接縱向生長。Hofstetter等對動物損傷的脊髓模型進(jìn)行MSCss脊髓內(nèi)移植，1周后動物步態(tài)明顯改善，移植5周后發(fā)現(xiàn)移植區(qū)和瘢痕組織區(qū)之問可見到新生神經(jīng)纖維束穿過。以上事實闡明，植入MSCs對脊髓損傷引起的運動功能障礙有明顯的療效。在腦缺血性疾病方面的研究：目前，許多研究發(fā)現(xiàn)將人骨髓MSCs移植給腦缺血動物模型，能有效減少梗死體積、減少神經(jīng)缺陷評分，并能明顯改善神經(jīng)功能的恢復(fù)。給永久性大腦中動脈栓塞大鼠靜脈輸注人骨髓MSCs，發(fā)現(xiàn)MSCs能進(jìn)入損傷腦區(qū)，其數(shù)量隨時間增長。在大鼠皮質(zhì)腦缺血后1周把純化的人骨髓MSCs移植到損傷周圍皮質(zhì)區(qū)能明顯改善大鼠的感覺運動功能，組織學(xué)分析移植的MSCs體現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(GFAP)、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(GalC)和神經(jīng)元標(biāo)志物，闡明移植的MSCs能向神經(jīng)元前體細(xì)胞或神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。鼠缺血腦組織的提取物培養(yǎng)能增進(jìn)人MSCs產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管源性生長因子，提醒腦缺血后的微環(huán)境變化也許與MSCs的治療作用有關(guān)。此外，Chert等還通過靜脈給大腦中動脈栓塞24h后的大鼠注射人MSCs，分析缺血邊緣帶的血管發(fā)生和宿主腦內(nèi)的VEGF及其受體水平，發(fā)現(xiàn)MSCs能增進(jìn)大鼠腦內(nèi)血管發(fā)生，也許與人MSCs增長了內(nèi)源性VEGF及其受體水平有關(guān)。Crigler等研究發(fā)現(xiàn)人MSCs移植后，其不一樣的細(xì)胞亞型體現(xiàn)不一樣的神經(jīng)細(xì)胞調(diào)控分子，對宿主神經(jīng)細(xì)胞的存活和神經(jīng)再生起到了一定的作用。在心血管性疾病方面的應(yīng)用研究據(jù)記錄，我國每年死于血管性疾病的人數(shù)高達(dá)300多萬，已占我國每年總死亡人數(shù)的34%-40%。由于溶栓治療、介入治療和外科治療等措施治療等措施的開展，死亡率有所下降。但目前的治療措施并不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)有的心肌病變，尤其是大面積心肌梗死后心肌細(xì)胞的大量喪失。因此移植外源性細(xì)胞有望成為恢復(fù)心肌功能的新的方略。MSCs具有向心肌細(xì)胞分化的潛能，研究表明自體MSCs動員或冠脈種植對急性心肌梗死，慢性缺血及心臟移植排斥反應(yīng)等均有明顯改善作用。將MSCs直接移植到小鼠心臟，移植的細(xì)胞可體現(xiàn)肌球蛋白重鏈，并向心肌細(xì)胞分化。Shake等采用犬LAD結(jié)扎60min的心肌梗死模型，分離自體MSCs，心肌梗死后2周將MSCs注射到心肌梗死區(qū)，發(fā)目前所有治療組動物心肌中均有MSCs存活，在MSCs移植后2周開始體現(xiàn)肌肉特異性蛋白，4周后心臟收縮功能明顯改善，提醒MSCs有心肌再生作用。將MSCs直接注射到梗死區(qū)或經(jīng)靜脈注射后，在損傷區(qū)均能見到MSCs定位，分化為心肌細(xì)胞，且心功能得到明顯改善并能防止有害的重構(gòu)。細(xì)胞移植是一種新型的治療心臟疾病如心肌梗死和心衰的措施，它的良好療效來源于移植細(xì)胞的活性分布、被動性提高心臟的機(jī)械功能、誘導(dǎo)血管新生、尚有對心臟生物學(xué)方面的其他作用。但移植細(xì)胞的療效以及最佳移植部位及移植時機(jī)有待深入研究在骨組織工程中的應(yīng)用由疾病、創(chuàng)傷所致的骨、軟骨損傷為臨床上常見且難以處理的問題，目前常規(guī)的治療措施有自體或者異體、異種骨移植，但它們都存在一定的問題和限制，難以完全滿足臨床需要。目前，以組織工程措施進(jìn)行軟骨再生的報道諸多，諸如在皮下注射軟骨細(xì)胞形成小的軟骨結(jié)節(jié)；運用軟骨膜片將培養(yǎng)分離的軟骨細(xì)胞固定在軟骨缺損部位使軟骨再生。因此，修復(fù)大面積軟骨缺損的生物載體應(yīng)是形狀可控制的三維支架構(gòu)造的體內(nèi)植入物，軟骨細(xì)胞在這種構(gòu)造中能增殖分化，并且形成具有正常軟骨成分(重要指糖胺聚糖和II型膠原)以及具有對應(yīng)的生物機(jī)械特性的再生軟骨。骨髓MSCs具有強(qiáng)大的自我擴(kuò)增、自我繁殖及多向分化的能力，它的易擴(kuò)增性能在很短的時間內(nèi)得到足夠的種子細(xì)胞，并且伴隨細(xì)胞的擴(kuò)增，細(xì)胞的性狀和分化特性并不會變化和喪失。在特定的成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，MSCs在體內(nèi)外均可分化為軟骨細(xì)胞或構(gòu)建出軟骨組織；Shapiro等用放射自顯影措施證明當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨損傷穿透軟骨下骨時，損傷周圍的軟骨細(xì)胞并不參與組織修復(fù)，修復(fù)組織重要來源于骨髓MSCs細(xì)胞。由于骨髓MSCs細(xì)胞獲得以便，MSCs的分離和純化技術(shù)已趨成熟，目前被認(rèn)為是軟骨組織工程最有發(fā)展?jié)摿Φ姆N子細(xì)胞。展望對MSCs進(jìn)行基因修飾以治療缺陷性疾病是目前的研究熱點。MSCs具有體外擴(kuò)增培養(yǎng)及自我更新的能力，轉(zhuǎn)入外源基因后不影響其特性，因此可成為基因治療理想的靶細(xì)胞。因此，可以將MSCs細(xì)胞治療和基因治療結(jié)合起來，通過改造的MSCs對基因缺陷、基因突變所致的疾病進(jìn)行治療。雖然運用MSCs進(jìn)行基因治療的前景樂觀，不過在臨床應(yīng)用中仍有許多安全性問題需要處理，如MSCs也許定植于腫瘤組織，為腫瘤細(xì)胞的生長提供合適的微環(huán)境；外源基因轉(zhuǎn)染MSCs的效率低下；基因變異也許導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；病毒性載體的生物安全性及基因修飾MSCs在患者體內(nèi)功能的檢測等。目前MSCs的重要來源為成人骨髓，但成人骨髓源MSCs細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且供者M(jìn)SCs的采集須行骨髓穿刺術(shù)，抽取大量骨髓（約500毫升），因此來源受到限制。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs在人胎兒和生后多種組織廣泛存在，包括骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝和臍血等。不過，胎兒的應(yīng)用又受到道德倫理和老式觀念的限制。有關(guān)臍血MSCs的報道存在較多爭議，且臍血MSCs的分離會損失臍血中造血干祖細(xì)胞，影響臍血干細(xì)胞的凍存和使用。因此，尋找新的MSCs的來源成為目前國內(nèi)外研究的熱點。我單位率先在國際上分離并且初步鑒定證明了臍帶MSCs特點，支持造血功能以及其他某些功能。我們研究發(fā)現(xiàn)，臍帶MSCs擁有諸多骨髓MSCss的特點。在神經(jīng)誘導(dǎo)條件下臍帶MSCs比骨髓MSCs更易于向神經(jīng)分化。此外臍帶MSCs細(xì)胞因子譜除了體現(xiàn)骨髓MSCs有關(guān)細(xì)胞因子外還額外體現(xiàn)GM-CSF和G-CSF.這些研究成果提醒臍帶MSCs的開發(fā)和運用品有非常廣闊的前景。在上述研究的基礎(chǔ)上一直進(jìn)行著后續(xù)研究，目前在促造血重建，免疫調(diào)整方面以及治療血管性疾病已經(jīng)獲得很大進(jìn)展，為其此后的臨床應(yīng)用奠定了堅實的理論基礎(chǔ)和技術(shù)平臺。（二）研究開發(fā)和產(chǎn)業(yè)內(nèi)容及總體目的研究開發(fā)和產(chǎn)業(yè)內(nèi)容1．多種組織間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，純化和培養(yǎng)，以及生物學(xué)特性研究目前MSCs的重要來源為成人骨髓，但成人骨髓源MSCs細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，因此來源受到限制。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs在人胎兒和生后多種組織廣泛存在，包括骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝和臍血等，因此，尋找新的MSCs的來源成為目前國內(nèi)外研究的熱點。（1）骨髓、胎盤及臍帶MSCs的制備：應(yīng)用膠原酶和胰酶相結(jié)合的酶直接消化法，通過磁珠篩選，從胎盤和臍帶中獲得大量的MSCs。對比采用不一樣培養(yǎng)基培養(yǎng)胎盤及臍帶MSCs，通過檢測MSCs的增殖和分化潛能的差異，建立MSCs的最適培養(yǎng)措施。（2）骨髓、胎盤及臍帶MSCs的生物學(xué)特性、免疫調(diào)整、支持造血等功能研究：（3）骨髓、胎盤及臍帶MSCs多向誘分化；2．間充質(zhì)干細(xì)胞治療重大疾病的研究（1）治療惡性血液病作用的研究（2）治療血管性疾病作用的研究血管性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康、影響患者生活質(zhì)量，尚缺乏有效的治療方案。干細(xì)胞移植為這些血管病變和損傷的治療帶來了但愿，因此，充足運用來源豐富、取材以便的間充質(zhì)干細(xì)胞的可塑性，開展對血管性疾病防治新措施的研究具有十分重要的現(xiàn)實意義和社會意義。重要研究內(nèi)容：=1\*GB3①建立內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少及功能缺損的動物模型,檢測該模型動脈的病理學(xué)形態(tài)及功能的變化，觀測與否有動脈粥樣硬化的形成。篩選出增長內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量、提高其功能的因子及轉(zhuǎn)染后能提高內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的基因。用這些因子處理內(nèi)皮祖細(xì)胞或基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，然后移植到實行內(nèi)膜球囊損傷術(shù)的兔體內(nèi)，觀測內(nèi)膜的修復(fù)狀況，明確提高內(nèi)皮祖細(xì)胞功能能否防治動脈粥樣硬化的形成。=2\*GB3②間充質(zhì)干細(xì)胞局部移植治療肢體缺血性疾?。和庵苎懿∽兡Ｐ徒ⅲ禾悄虿⌒∈笙轮⒀懿∽?，結(jié)扎下肢動脈致嚴(yán)重缺血。將MSC局部注射到病變下肢，然后通過下肢活動能力受限評分以及下肢缺血評分來評估功能恢復(fù)。PBS做對照，骨髓來源的MSC為陽性對照。運用激光多普勒血流檢測局部血流恢復(fù)狀況，血管造影檢測局部側(cè)支循環(huán)的形成。=3\*GB3③間充質(zhì)干細(xì)胞作為基因治療的載體，轉(zhuǎn)染PDGF基因后其功能研究：通過PCR將目的基因PDGF擴(kuò)增，然后酶切，連接以及重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆，重組腺病毒質(zhì)粒的純化，重組腺病毒的包裝、獲取、鑒定。重組腺病毒的擴(kuò)增與純化以及病毒梯度的測定。然后感染臍帶MSC，反復(fù)感染。含CMV啟動子重組腺病毒感染效率的測定：運用匯報基因鑒定。PDGF轉(zhuǎn)染的臍帶MSC的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞增殖能力、抗凋亡能力、免疫表型與否變化及基因修飾過的MSC的多向分化能力有無變化。細(xì)胞的條件培養(yǎng)基搜集后用Elisa措施檢測分泌的因子PDFG、VEGF，bFGF等有無變化。=4\*GB3④轉(zhuǎn)染PDGF基因的臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞局部移植防治糖尿病微血管病變：鏈尿菌素誘導(dǎo)的裸鼠，在血糖尿糖增高后1－2個月，持續(xù)觀測其下肢毛細(xì)血管密度，小動脈密度和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡狀況。局部移植PDGF修飾的MSC細(xì)胞，觀測肢體功能恢復(fù)狀況，下肢血流以及毛細(xì)血管密度等。觀測肌肉組織的PDGF等細(xì)胞因子的體現(xiàn)。同步研究內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡狀況。（3）軟骨組織工程中間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床前應(yīng)用研究使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨,探索其體內(nèi)成軟骨的能力,并與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損成果做比較性研究,意在為軟骨修復(fù)開辟新的途徑。本試驗用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞,用同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植作為陽性對照組、缺損不處理作為陰性對照組,以糖胺聚糖和II型膠原或聚乳酸(PLA)為支架,移植修復(fù)兔全層關(guān)節(jié)軟骨缺損,通過對體內(nèi)修復(fù)組織及滑膜的檢測,確定臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對軟骨缺損的修復(fù)作用及免疫反應(yīng)。重要研究內(nèi)容:=1\*GB3①臍帶MSCs體外定向分化為軟骨細(xì)胞及鑒定選擇最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)因子和增殖因子、誘導(dǎo)培養(yǎng)時間，研究臍帶MSCs向軟骨細(xì)胞分化的條件。=2\*GB3②臍帶MSCs和誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)研究支架材料聚乳酸(PLA)對誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖能力、粘附能力和免疫學(xué)功能等生物特性的研究。=3\*GB3③誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增進(jìn)全層關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的動物試驗研究使用臍帶MSCs以及軟骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞，以糖胺聚糖和II型膠原或聚乳酸(PLA)為支架，移植修復(fù)兔全層關(guān)節(jié)軟骨缺損，通過對體內(nèi)修復(fù)組織及滑膜的檢測，并與兔骨髓MSCs修復(fù)軟骨缺損成果做比較，確定臍帶MSCs以及軟骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞對軟骨缺損的修復(fù)作用及免疫反應(yīng)。探索比較它們體內(nèi)修復(fù)軟骨的能力。（4）IL-27基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞治療自身免疫病的臨床前研究間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞治療和基因治療方面具有不可忽視的優(yōu)勢，以間充質(zhì)干細(xì)胞為載體的基因治療將成為未來研究的熱點。IL-27是近來發(fā)現(xiàn)的最重要的具有克制炎癥免疫作用的細(xì)胞因子?；陂g充質(zhì)干細(xì)胞和IL-27的抗炎作用在臨床上的廣泛應(yīng)用前景，我們將兩者結(jié)合起來：建立高體現(xiàn)IL-27的間充質(zhì)干細(xì)胞系，期望其對自身免疫病提供新的治療方略。研究內(nèi)容（1）高體現(xiàn)IL-27的MSC治療膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）：建立小鼠的關(guān)節(jié)炎模型，將MSC或高體現(xiàn)IL-27的MSC注入關(guān)節(jié)炎部位或小鼠腹腔內(nèi)，觀測其治療作用。比較治療組和對照組小鼠關(guān)節(jié)病變處的病理變化，免疫細(xì)胞構(gòu)成，以及多種細(xì)胞因子的體現(xiàn)實狀況況。（2））高體現(xiàn)IL-27的MSC治療試驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）：建立小鼠的EAE模型，將MSC或高體現(xiàn)IL-27的MSC注入小鼠腦內(nèi)的病變部位，觀測小鼠的生存期。腦內(nèi)病變部位的細(xì)胞因子的體現(xiàn)，各免疫細(xì)胞所占的比例和功能狀態(tài)，腦部組織病理變化狀況。（3）高體現(xiàn)IL-27的MSC治療自身免疫性肝炎：建立自身免疫性肝炎模型。將MSC或高體現(xiàn)IL-27的MSC從尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。觀測小鼠的生存期，腸子的病變狀況，病理變化，腸道和脾臟細(xì)胞因子的體現(xiàn)實狀況況和各免疫細(xì)胞亞型的構(gòu)成狀況。（4）高體現(xiàn)IL-27的MSC和造血干細(xì)胞共移植治療再生障礙性貧血：建立小鼠的再障模型，對其進(jìn)行allo-BMT的同步，尾靜脈輸注MSC或高體現(xiàn)IL-27的MSC。觀測對再障的治療效果，并觀測小鼠異基因骨髓移植(allo-BMT)后移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率和生存率的變化。流式細(xì)胞儀檢測受鼠各T細(xì)胞亞群的差異，檢測細(xì)胞因子的分泌狀況和及骨髓的病理學(xué)變化。3．間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用中安全性研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用，屬于同種異體的細(xì)胞移植，我們對培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行致瘤性、全身性毒性等方面進(jìn)行安全性評價。研究內(nèi)容（1）體外致瘤試驗：軟瓊脂培養(yǎng)法是體外檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞致瘤性最為常用的措施，與細(xì)胞的惡性程度有很大的符合率。一般腫瘤細(xì)胞在這樣的培養(yǎng)條件下1－3周可見克隆形成，在表層瓊脂內(nèi)成桑椹狀。用光學(xué)顯微鏡觀測，可見克隆內(nèi)的細(xì)胞呈圓形，透亮，排列成團(tuán)。一般認(rèn)為由16個細(xì)胞以上構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)為一種克隆，克隆內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目伴隨培養(yǎng)時間增長而增多。假如細(xì)胞成顆粒狀，細(xì)胞輪廓不清晰，闡明細(xì)胞已經(jīng)死亡。假如持續(xù)培養(yǎng)2周仍未見克隆形成，則考慮接種的細(xì)胞沒有腫瘤細(xì)胞的特性，間接反應(yīng)這種細(xì)胞的移植后無致瘤性。（2）體內(nèi)致瘤性試驗：將細(xì)胞制劑接種到動物體上，觀測其成瘤性，由于裸鼠具有如下特點：先天性胸腺缺陷，胸腺依賴性免疫功能缺乏，T細(xì)胞功能靠近于零，但B細(xì)胞功能大體正常，異種移植時無排斥反應(yīng)。因此裸鼠一般作為接種的動物。接種的措施可以是局部皮下接種或尾靜脈注射，接種后持續(xù)觀測1個月，根據(jù)肉眼觀測和病理切片觀測與否有腫瘤形成來反應(yīng)檢測的細(xì)胞群體與否具有致瘤性。腫瘤細(xì)胞局部接種后約1個月左右（最短在3天）可見注射的局部有腫瘤出現(xiàn)，甚至有轉(zhuǎn)移瘤（一般在肺部）形成。經(jīng)病理組織學(xué)檢查可以確定腫瘤與否由接種的細(xì)胞產(chǎn)生。腫瘤細(xì)胞經(jīng)靜脈注射，在移植后1月左右可在不一樣的組織器官內(nèi)觀測到腫瘤形成。經(jīng)病理組織學(xué)檢查可以確定腫瘤與否由接種的細(xì)胞產(chǎn)生。（3）全身臟器急、慢性毒性試驗研究，重要通過在NOD/SCID小鼠中注射相稱于臨床病人用量100倍的臍帶原始間充質(zhì)干細(xì)胞，在急性試驗中持續(xù)觀測一周試驗動物的體重，活動，飲食，與否腹瀉，生存狀況。慢性毒性試驗重要觀測細(xì)胞移植6個月后與否對造血，肝腎功能導(dǎo)致慢性損害，觀測指標(biāo)重要為血常規(guī)，生化指標(biāo)及處死后各重要臟器的病理學(xué)檢查，通過這些指標(biāo)綜合判斷間充質(zhì)干細(xì)胞與否存在嚴(yán)重的毒性作用?？傮w目的預(yù)期可獲得的成果、知識產(chǎn)權(quán)和人才培養(yǎng)狀況:建立起間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品、技術(shù)和資源平臺、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫，建立完整的生產(chǎn)和質(zhì)量控制體系；明確間充質(zhì)干細(xì)胞在治療血液系統(tǒng)惡性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及軟骨組織工程中的作用以及機(jī)制；明確間充質(zhì)干細(xì)胞治療疾病的安全性；初步制定上述幾種疾病的臨床試驗方案，向國家食品藥物監(jiān)督管理局申請Ⅰ期臨床研究；申請專利項；刊登SCI文章篇；臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞獲得SFDA或者衛(wèi)生行政主管部門對應(yīng)的臨床批文；培養(yǎng)博士后名，博士生名，碩士生名。（三）實行條件優(yōu)秀的學(xué)科帶頭人、成熟和完善的系列技術(shù)、國際水平先進(jìn)的試驗室和配套設(shè)備為支撐：課題的承擔(dān)單位不僅具有學(xué)科優(yōu)勢，有一支年富力強(qiáng)的、構(gòu)造合理的優(yōu)秀研究隊伍，課題負(fù)責(zé)人在所屬領(lǐng)域的工作均獲得了國外同行的高度評價和承認(rèn)。并且在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞移植和基因治療的關(guān)鍵試驗技術(shù)和試驗室及配套的儀器設(shè)備方面也有著明顯的優(yōu)勢，如在活細(xì)胞顯微分析、干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化和擴(kuò)增、細(xì)胞移植治療以及基因治療等技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)具有國際先進(jìn)水平