微生物實驗報告

功能微生物的篩選、培養(yǎng)與選育生科院09012109091711月30日概要：以產(chǎn)抗生素細(xì)菌的篩選和選育為目的，通過培養(yǎng)基制備及滅菌、菌種的分離純化、菌種的鑒定、培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及誘變育`種五個試驗，學(xué)習(xí)有關(guān)的試驗技術(shù)和措施.關(guān)鍵詞：分離純化、滅菌、酶活性、誘變一、材料與措施：1.11牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制配方（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，瓊脂20，pH7.0～7.2。注：配制3000mL，分裝20支固體斜面試管（不超過試管高度的1/3）和20支液體試管（不超過試管高度的1/3），其他分裝于1L三角瓶，每瓶500mL。不一樣pH值配制1(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5pH4.0

配制2(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5pH7.2不一樣碳源

配制3：淀粉3g，蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去離子水1000mLpH7.2

配制4：葡萄糖3g，蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去離子水1000mLpH7.2不一樣氮源

配制5：硝酸鈉10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去離子水1000mLpH7.2

配制6：蛋白胨10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去離子水1000mLpH7.21.12無菌水的準(zhǔn)備50ml三角瓶內(nèi)盛入18ml蒸餾水，放入8～10顆玻璃小珠，加蓋瓶塞，包扎待滅菌；50ml三角瓶內(nèi)盛入18-20ml蒸餾水，加蓋瓶塞，包扎待滅菌；1.13滅菌材料與器皿的包扎1.試管的包扎：7支試管為一包扎單位，用報紙將試管塞部分包扎嚴(yán)實并繩之以紗線；2.三角瓶的包扎：用報紙將瓶塞部分包扎嚴(yán)密，并以紗線系之；3.培養(yǎng)皿的包扎：6個平皿為一包扎單位，用報紙以滾筒方式將其包緊；4.玻璃移液管的包扎：每1支吸管為包扎單位，用細(xì)長條報紙以卷煙方式扎之5.1.5mL離心管的包扎：6個離心管為包扎單位，用報紙包成小包。固體斜面的擺放注：斜面長度不超過試管長度的1/21.14滅菌首先將具有培養(yǎng)基的三角瓶和試管放入滅菌鍋，注意不要讓培養(yǎng)基傾斜以防溢出，然后再放入其他的玻璃器材。滅菌物品之間不要擺放太擠，以保證高壓蒸汽滅菌可以徹底。1.21土壤樣品的采集

在國教中心前取土，天氣晴朗，用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5～25cm處的土樣10～25g，裝入事先準(zhǔn)備好的滅菌信封內(nèi)。1.22制備土壤稀釋液：

稱取土壤2g，放入18mL帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中，振蕩5min，即為稀釋10－1的土壤懸液，土壤懸液80℃水浴加熱10分鐘，然后在離心管中依次稀釋至10-2、10-3等稀釋度。1.23制備淀粉培養(yǎng)基平板制5塊牛膏蛋胨培養(yǎng)基平板

詳細(xì)制法為：倒入融化好的淀粉瓊脂培養(yǎng)基（溫度為不燙手為宜）并輕輕搖擺混勻，置于桌面冷卻為平板。

在無菌培養(yǎng)皿底部注明個人信息（分離菌名、稀釋度、組別、班級）。1.24a吸取稀釋液

無菌操作法分別吸取10－1、10－2、10－3土壤稀釋液0.1mL，分別加在已制好的3塊淀粉平板培養(yǎng)基上。b涂板

用玻璃刮鏟將稀釋液在培養(yǎng)機上充足混勻鋪平，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。1.25培養(yǎng)置于504房間30℃培養(yǎng)24小時。1.26觀測水解圈的產(chǎn)生并測其半徑。a、48小時后，在之前稀釋涂布的三塊淀粉培養(yǎng)基上選用經(jīng)典的單個菌落，并用記號筆在平板背面進(jìn)行編號。然后將編號后的菌落用無菌牙簽挑取，在備用的淀粉培養(yǎng)基平板上分別劃線接種（編號與被挑菌落相似）b、將碘液滴加在之前稀釋涂布的三塊淀粉培養(yǎng)基上，觀測與否有水解圈的產(chǎn)生，并測量其半徑。c、根據(jù)水解圈的有無以及大小鑒定有關(guān)菌落與否產(chǎn)生淀粉酶，并記錄該菌落編號，并將接種有分離平板上菌落的備用淀粉瓊脂平板冰箱保留留作后續(xù)試驗之用。1.27菌種活化在1.28前的48h將平板菌種接入牛肉膏蛋白胨液體試管活化，并接種一支斜面試管保藏。提前18h按0.2％接種量分別轉(zhuǎn)接如下五種液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)2牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基18℃培養(yǎng)3牛肉膏檸檬酸鈉培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)4牛肉膏硝酸鈉培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)5牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基pH430℃培養(yǎng)1.28不一樣條件對淀粉酶活性的影響測定a倒制淀粉培養(yǎng)基平板一塊。培養(yǎng)基倒入量規(guī)定不要太多，盡量薄一點，鋪滿平板底部即可。b用小濾紙片分別蘸取各瓶18小時培養(yǎng)物少許，規(guī)定不要蘸太多，保證每片所蘸培養(yǎng)物盡量一致c如右圖所示，將小濾紙片貼在淀粉培養(yǎng)基表面，并分別在底板上做上標(biāo)識d將平板置于30℃培養(yǎng)箱作用1h。然后將碘液鋪在平板上，分別測量水解圈的大小1.29不一樣條件對菌體生長量影響的測定a將培養(yǎng)18小時后液體搖瓶培養(yǎng)物分別取出3mL于比色杯中，在721型分光光度計600nm波長下測定吸光度。假如菌液濃度過大，可做合適稀釋后再進(jìn)行測量。b分別記錄多種不一樣培養(yǎng)基和不一樣培養(yǎng)條件下OD600值大小，評價對菌體生長量的影響。產(chǎn)淀粉酶菌種的鑒定1.31產(chǎn)淀粉酶待檢菌的培養(yǎng)特性與形態(tài)特性的觀測與鑒定1.培養(yǎng)特性的觀測：菌落形狀與大小，邊緣，表面，隆起形狀，透明度，菌落與培養(yǎng)基顏色等；2.細(xì)菌細(xì)胞的顯微觀測：細(xì)胞形狀是桿狀（長桿或短桿）還是球狀？有無芽孢？有無莢膜？3.細(xì)菌的革蘭氏染色：按照試驗二的操作措施進(jìn)行（設(shè)置原則的革蘭氏陽性和陰性菌為對照）。1.32細(xì)菌的16SrDNA分子鑒定反應(yīng)體系：在一種PCR管中用微量移液槍依次加入列物質(zhì)：Taqbuffer（10×）

2.5μlMgCl2（25mM）1μldNTP（2.5mM）

2.5μlPrimerForward（50mM）

1μlPrimerReverse（50mM）

1μlddH2O

16.5μl用滅菌牙簽挑取單菌落于PCR管中，使菌體懸浮于反應(yīng)體系中。rTaq（2U/μl）

0.5μlPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15min后，95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25個循環(huán)，72℃延伸10min。1.33瓊脂糖凝膠電泳1.制膠：配制0.7%瓊脂糖溶液20mL，用1×TAE電泳緩沖液做溶劑，加熱溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待膠凝固；2.制樣：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR管，吸取5μl與1μl6×樣品Buffer混合后所有點入浸于TAE電泳緩沖液中的瓊脂糖凝膠的樣品孔中；3.電泳：100V電泳20min；4.染色：將凝膠置于樣品染料溴化乙錠中染色；10min，然后將凝膠置于紫外燈下進(jìn)行檢測，當(dāng)在凝膠上出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA條帶（約1.5Kb），則認(rèn)為是PCR陽性，這時將與此電泳樣品對應(yīng)的PCR反應(yīng)管放置冰箱短期保留。1.34PCR擴增片段測序獲得的PCR陽性樣品由專人送往測序企業(yè)進(jìn)行測序，大概一周后測序成果可以返回，然后在電腦的有關(guān)軟件上進(jìn)行讀序。1.35序列比對分析使用NCBI網(wǎng)站看待測菌的16SrDNA序列與數(shù)據(jù)庫中多種菌的16SrDNA序列進(jìn)行比對。登陸美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站，使用BLASTn在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫中進(jìn)行同源性搜索。從Genebank中選擇近與待測菌目的基因序列同源性最高的已知分類的菌株的16SrRNA基因序列,初步確定待測菌的分類位置。用Clustal軟件將已知分類菌株的16SrRNA序列與待測菌的16SrRNA序列進(jìn)行多序列比較。1.41菌種的活化與接種每組提前40h將分離的產(chǎn)淀粉酶菌株轉(zhuǎn)接至試管斜面，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，每組挑取一環(huán)活化菌株，接種至含10ml淀粉培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，于25℃，150r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)。1.42誘變a.菌懸液的制備取出培養(yǎng)約16h的搖瓶，取0.5ml菌懸液（吸取前三角瓶要搖勻）于離心管中（每組3管），5000r/min離心5min，棄上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2次，加入1.5ml無菌生理鹽水制成菌懸液。b.平板制作融化淀粉培養(yǎng)基，每組倒4塊平板，在平板上做好標(biāo)識。c.誘變處理(1)啟動紫外燈預(yù)熱10-20min。(2)紫外處理：取制備好的菌懸液3mL移入6cm的無菌培養(yǎng)皿中，將上述平皿置于紫外燈下的脫色搖床上，打開皿蓋，距離紫外燈管30cm，照射3min（單號排）或者6min（雙號排），蓋上皿蓋。(3)稀釋菌液：在超凈臺內(nèi)，將照射后的菌懸液用無菌水按10倍稀釋法依次稀釋成10-1-10-5（在dorf管中進(jìn)行）。(4)涂布平板：取10-3、10-4（單號組）和10-4、10-5（雙號組）兩個稀釋度的菌懸液各0.1ml涂布均勻。以同樣的操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌懸液稀釋涂布平板作為對照。平板于37℃倒置培養(yǎng)48h(用黑布包好平板)。1.43計算成活率和致死率a.存活率將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計算出對照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。b．致死率將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計算出對照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。1.44觀測誘變效應(yīng)在平板菌類計數(shù)后，分別向菌落數(shù)在5~6個左右的平板內(nèi)加入碘液，分別測量透明圈直徑與菌落直徑并計算比值(H/C值)，與對照平板進(jìn)行比較（紫外照射和對照組隨機選出6個算平均值）。選用H/C比值大的菌落移接到新鮮牛肉膏斜面上培養(yǎng)，用于復(fù)篩。理解微生物分類與鑒定中的基本程序和常規(guī)試驗技術(shù)與措施；2.熟悉16SrRNA基因PCR擴增進(jìn)行細(xì)菌鑒定的基本原理并初步掌握PCR的操作技術(shù)二、試驗成果21765431.26觀測水解圈的產(chǎn)生并測其半徑。2176543半徑：1號2號3號4號5號6號7號2.5mm2.5mm4mm無水解圈1.5mm0.5mm0.5mm后期試驗選用的為三號。

1.29不一樣條件對菌體生長量影響的測定分別記錄多種不一樣培養(yǎng)基和不一樣培養(yǎng)條件下OD600值大小，評價對菌體生長量的影響。培養(yǎng)基類型OD600值牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（30℃培養(yǎng)）0.770牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（18℃培養(yǎng)）0.913牛肉膏檸檬酸鈉培養(yǎng)基（30）0.440牛肉膏硝酸鈉培養(yǎng)基（30）0.770牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基pH4（30）0.0051.31產(chǎn)淀粉酶待檢菌的培養(yǎng)特性與形態(tài)特性的觀測與鑒定1.培養(yǎng)特性的觀測：菌落形狀與大小，邊緣，表面，隆起形狀，透明度，菌落與培養(yǎng)基顏色等；小而均勻、單個分散、較濕、表面突起、不透明呈白色。2.細(xì)菌細(xì)胞的顯微觀測：細(xì)胞形狀是桿狀（長桿或短桿）還是球狀？有無芽孢？有無莢膜？細(xì)菌細(xì)胞是桿狀，無芽孢，無莢膜。ResultofG-3.細(xì)菌的革蘭氏染色：按照試驗二的操作措施進(jìn)行（設(shè)置原則的革蘭氏陽性和陰性菌為對照）。ResultofG-1.35序列比對分析T-3C-4C-3T-31.43計算成活率和致死率T-3C-4C-3T-3T-4T-4C-3C-4T-3T-4菌落個數(shù)41255a.存活率將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計算出對照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。試驗誤差較大，無法計算存活率。b．致死率將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計算出對照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。試驗誤差較大，無法計算致死率。1.44觀測誘變效應(yīng)在平板菌類計數(shù)后，分別向菌落數(shù)在5~6個左右的平板內(nèi)加入碘液，分別測量透明圈直徑與菌落直徑并計算比值(H/C值)，與對照平板進(jìn)行比較（紫外照射和對照組隨機選出6個算平均值）。C-4C-3C-4C-3T-4T-3T-4T-3首先目視水解圈較大且無明顯變化。標(biāo)志測量成果如下(大小均為直徑，單位mm)：菌落序號123456菌落大小3321.51.52水解圈大小10910111011H/C值3.333.005.007.336.665.50菌落來源t-4t-4c-4t-3t-3c-3H/C值的平均值為5.13.測量成果顯示，-4的菌落經(jīng)6MIN紫外照射后H/C值有略微的變大。-3的菌落有略微的變小。三、討論：1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制過程中的注意事項a牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。本試驗中用的是后一種措施。b蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。c稱藥物時嚴(yán)防藥物混雜，一把牛角匙用于一種藥物，或稱取一種藥物后，洗凈、擦干，再稱取另一藥物，瓶蓋也不要蓋錯。d在瓊脂溶化的過程中，需不停攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最終補足所失的水分。e調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量\o"培養(yǎng)基"培養(yǎng)基的原始pH值，假如pH偏酸，用滴管向\o"培養(yǎng)基"培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達(dá)7.0～7.2。反之，則用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)整。盡量pH值不要調(diào)過頭，以防止回調(diào)，否則，將會影響\o"培養(yǎng)基"培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。在本試驗中明顯看到培養(yǎng)基顏色較清。也許原因是水過多。2、第二次斜面劃線較第一次有很大的進(jìn)步，經(jīng)驗如下：劃線時調(diào)取菌落應(yīng)適量，不要貪多，劃線速度與密度應(yīng)慢一點，不規(guī)定快，但過慢也不行，力度應(yīng)使接種環(huán)剛接觸培養(yǎng)基表面，技術(shù)成熟度方面還需要多加實踐與總結(jié)。3、培養(yǎng)基配好后為何要立即滅菌？怎樣檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的？培養(yǎng)基自身就是用來培養(yǎng)細(xì)菌的，里面的營養(yǎng)成分很適合細(xì)菌的生長，不立即來菌，細(xì)菌就會在里