脯氨酸含量測(cè)定

逆境脅迫下植物體脯氨酸含量測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私飧彼嵩谥参锟鼓嫘詻Q定中的作用。掌握脯氨酸提取和測(cè)定的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】逆境條件下(干旱、鹽堿、熱、冷害、凍害)，植物體內(nèi)脯氨酸含量會(huì)顯著增加，并且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)，因此脯氨酸可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。測(cè)定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。酸性條件下，茚三酮和脯氨酸反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色化合物,產(chǎn)物在520nm波長(zhǎng)下具有最大吸收峰。用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色,再用甲苯萃取，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，顏色的深淺即表示脯氨酸含量的高低?！緦?shí)驗(yàn)材料】材料：小麥幼苗：對(duì)照100mM、200mMNaCl處理48h5%、15%PEG-6000處理48h試劑：3%磺基水楊酸；冰醋酸；甲苯；2.5%酸性茚三酮溶液；脯氨酸母液50g/ml器材：天平，燒杯，分光光度計(jì)，研缽，容量瓶，具塞試管，移液管，膠頭滴管，水浴鍋酸性茚三酮溶液：稱取1.25g茚三酮溶于30mL冰乙酸和20mL6M磷酸溶液中，攪拌加熱(低于70°C)溶解，冷卻后置棕色瓶中，4°C保存可使用2~3天?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定分別吸取1ml系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液于6個(gè)試管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml2.5%的酸性茚三酮，于沸水浴中加熱30min。冷卻后準(zhǔn)確加入4ml甲苯，振蕩30S，靜置片刻,使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。輕輕吸取各管上層甲苯溶液至比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，于520nm進(jìn)行比色。樣品的測(cè)定稱取不同處理的小麥葉片各0.5g，于2.5ml3%磺基水楊酸試管中，沸水浴中提取10min。吸取1ml上清于另一試管中，加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml2.5%的酸性茚三酮，混合液于沸水中顯色30min。冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，萃取完全后用吸管輕輕吸取上層紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，在520nm比色?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】查標(biāo)準(zhǔn)曲線，得脯氨酸含量c(gg)脯氨酸含量(gg.g-1)=cX(v/a)/w其中V為提取液總體積ml;a為測(cè)定液體積ml；W為樣品質(zhì)量g。

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度(pg/mL)246810OD52010.0700.1400.2010.2930.33120.0870.1320.1930.3040.34130.0880.1510.2230.3180.344平均0.0820.1410.2060.3050.339脯氯酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線0.3000.2000.1000.3000.2000.100—系列11015濃度(Mg/BL)2.樣品測(cè)定處理平行質(zhì)量OD520對(duì)照10.20180.20430.1570.17320.20680.188100mMNaCl10.20180.20260.6150.65720.20330.698200mMNaCl10.20060.20201.0080.94220.20340.8755%10.20960.20950.0990.167PEG-600020.20930.23415%10.20280.20410.5860.587PEG-60002020530.587將測(cè)得樣品的OD520值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的幾種處理的脯氨酸含量分別為:處理OD520脯氨酸濃度(pg/mL)質(zhì)量(g)脯氨酸含量(Pg/g)對(duì)照0.1734.7640.2043233.2100mMNaCl0.65719.0410.2026940.1200mMNaCl0.94227.4480.20201358.85%PEG-60000.1674.5870.2095219.015%PEG-60000.58716.9760.2041832.0【實(shí)驗(yàn)討論】采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減小了其他氨基酸的干擾，快速簡(jiǎn)便，而且不受樣品狀態(tài)（干或鮮樣）限制。實(shí)驗(yàn)中甲苯的作用主要是萃取，以排除其他可能和茚三酮產(chǎn)生顯色反應(yīng)的物質(zhì)使得測(cè)量值偏高。但同時(shí)有研究顯示，未經(jīng)甲苯萃取和經(jīng)甲苯萃取后所得的脯氨酸含量值得趨勢(shì)是相同的，即應(yīng)該高的數(shù)值兩種方法都會(huì)高，因此，從污染小，經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)便的方向考慮，如果不對(duì)脯氨酸進(jìn)行精確的定量，只是用于作為一個(gè)植物抗性的生化指標(biāo)，可以不使用甲苯的萃取。實(shí)驗(yàn)中在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，所設(shè)置的濃度范圍不太合適，因?yàn)闆](méi)能把樣品的OD520值包含進(jìn)去。因此標(biāo)準(zhǔn)曲線并不是很可靠。應(yīng)該將濃度繼續(xù)增加，盡量使樣品測(cè)定的OD520值能夠包含進(jìn)入曲線的濃度范圍內(nèi)，所得結(jié)果才準(zhǔn)確。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以觀察到，隨著脅迫程度的增加，脯氨酸的含量也會(huì)顯著增加。因此，可以說(shuō)明脯氨酸的含量在一定程度上是植物遭受脅迫大小的反映。而通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫比干旱脅迫對(duì)小麥造成的影響更大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，經(jīng)過(guò)5%PEG-6000（輕度干旱脅迫）處理的小麥葉片內(nèi)的脯氨酸含量甚至比對(duì)照組的脯氨酸含量還要低（但相差不多）。而其他幾種脅迫均有顯著的使脯氨酸增加的效果，因此，除了操作過(guò)程中的一些誤差外，最重要的是輕度干旱可能不會(huì)對(duì)小麥造成太大的影響，或者其他的代謝機(jī)制可以幫助小麥抵抗輕微干旱，脯氨酸增加不明顯。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有極強(qiáng)的親水性及水合作用。因此干旱時(shí)脯氨酸的積累能夠有效地防止脫水。脯氨酸是植物在鹽脅迫下的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，它不僅是生物大分子的保護(hù)劑和羥基的清除劑，還是植物從脅迫條件恢復(fù)正常過(guò)程中迅速、有效的氮源、碳源和還原劑。脯氨酸能夠防止質(zhì)膜透性的變化，對(duì)質(zhì)膜的完整性有保護(hù)作用，原因可能是脯氨酸與膜磷脂及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用，以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。高等植物中脯氨酸的合成有兩種途徑：谷氨酸途徑和鳥(niǎo)氨酸途徑，兩者的主要區(qū)別在于初始底物分別為谷氨酸（Glu）和鳥(niǎo)氨酸（Orn）。在滲透脅迫和氮素缺乏情況下，谷氨酸途徑是合成脯氨酸的主要來(lái)源；而在氮素供應(yīng)充足的情況下，鳥(niǎo)氨酸途徑占主導(dǎo)地位。脯氨酸合成發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，P5CR（毗咯啉-5，-羥酸還原酶）和P5CS（毗咯啉-5,-羥酸氧化酶）是脯氨酸生物合成過(guò)程中的兩個(gè)重要酶，后者是限速酶。除了高鹽和干旱脅迫外，脯氨酸在低溫脅迫時(shí)也起到重要作用。脯氨酸的親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過(guò)程，因而能降低冰點(diǎn)，，有防止細(xì)胞脫水的作用。另外，脯氨酸的積累與植物的代謝表現(xiàn)出一定的正相關(guān)性，同時(shí)能促進(jìn)酶核細(xì)胞膜的滲透調(diào)節(jié)。有些植物中，脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化會(huì)引起代謝酶的變化；當(dāng)植物細(xì)胞受到逆境脅迫時(shí)，脯氨酸通過(guò)保護(hù)生物大分子的功能結(jié)構(gòu)為生理生化反應(yīng)提供足夠的自由水和活性物質(zhì)