PCR實驗室設計說明分析

PCR試驗室設計說明PCR試驗室分為四個區(qū)域，進入各工作區(qū)域必需嚴格依據單一方向進行，不同的工作區(qū)域運用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時,不得將工作服帶出，四區(qū)域分別為：.試劑配制區(qū)n.樣品處理區(qū)n.核酸擴增區(qū)n.產物分析區(qū)n如運用全自動分析儀，區(qū)域可適當合并,三四區(qū)可合并為擴增產物分析。各區(qū)的功能是：試劑打算區(qū)：擴增試劑的配制、分裝和保存。樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝；核酸提取、保存和加樣。擴增產物分析區(qū)：擴增產物的測定、結果分析、登記與報告。1.2擴增前區(qū)與擴增后區(qū)應嚴格分開，須運用不同的房間，兩區(qū)之間最好有肯定的間隔。1.3運用商品化試劑盒可在樣品處理區(qū)進行少量試劑配制。4在滿意下列操作和清潔處理要求的前提下樣品處理區(qū)和試劑打算區(qū)可設在同一房間內：1在生物平安柜內操作。每個試驗人員、試驗組分別運用各自的試劑與耗材。盛放污染材料的器皿密封并一次性運用。交叉污染，進入各個工作區(qū)域必需嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和打算區(qū)一標本制備區(qū)一擴增反應混合物配制和擴增區(qū)一擴增產物分析區(qū)。各試驗區(qū)之間的試劑與樣品傳遞應通過傳遞窗進行。PCR試驗室平面布置示意圖如圖1所示。圖1PCR試驗室平面布置示意圖3試驗室空調通風系統設計與壓力限制PCR試驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避開各個試驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采納全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格限制送、排風的比例以保證各試驗區(qū)的壓力要求。該試驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應干脆運輸至該區(qū)，不得經過其他區(qū)域。試劑原材料必需貯存在本區(qū)內，并在本區(qū)內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的限制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。.2標本制備區(qū)該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存與其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避開從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避開在本區(qū)內不必要的走動。擴增反應混合物配制和擴增區(qū)該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣本制備區(qū)）的加入和主反應混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應混合液等也可在本區(qū)內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必需打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危急性，其次次加樣必需在本區(qū)內進行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避開氣溶膠從本區(qū)漏出。為避開氣溶膠所致的污染，應盡量削減在本區(qū)內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。擴增產物分析區(qū)該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如運用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。本區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避開擴增產物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。4污染的預防與限制PCR試驗室設計的核心問題是如何避開污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產物的污染；自然基因組DNA的污染；試劑的污染以與標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，試驗就必需停止，直到找到污染源為止，而且試驗結果必需作廢，需重新進行試驗。所以發(fā)生污染后再圍繞試驗室來找尋污染源不但耗時而且繁瑣，奢侈人力物力。因此要避開污染，首先應是預防，而不是解除。工作區(qū)域的嚴格劃分(1)各個試驗區(qū)域設置合理；(2)各個試驗區(qū)域要有明顯的標記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等),以避開各個不同試驗區(qū)域設備物品、試劑等發(fā)生混淆。合理的系統設置(1)合理的空調通風系統設置，盡量采納全送全排的空調系統；(2)嚴格的氣流壓力限制，保證不同的試驗區(qū)內不同的壓力要求。.3規(guī)范的操作(1)臨床基因擴增檢驗試驗室的技術人員必需進行上崗培訓，經培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作；(2)在試驗操作過程中，操作者必需戴手套，并常常更換。止匕外，操作中運用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施；(3)清潔工作與時、正確。試驗工作結束后，必需馬上對本區(qū)進行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照耀消毒外，對一些試驗設備還應進行高壓消毒處理。.4嚴格的管理(1)嚴格限制進出試驗室的人員。與試驗無關的人員不得隨意進出試驗室，有條件的狀況下要設置獨立的通道和進出整個試驗區(qū)的門；(2)在各個試驗區(qū)域運用帶有明顯區(qū)分標記的工作服(如不同顏色)，當工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；(3)盡量削減在試驗區(qū)內不必要的走動以削減交叉污染的可能性。(4)擴增產物分析區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，廢液不能在試驗室中傾倒，必需經消毒液浸泡消毒后在遠離試驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統一處理，如焚燒等；(5)擴增產物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質，應特殊留意試驗人員的平安防護。.5完備的試驗室配套設施完備的試驗室配套設施是保證明驗工作的必要條件，應依據各個試驗室試驗內容的不同配備相應的設備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。PCR試驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避開各個試驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采納全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格限制送、排風的比例以保證各試驗區(qū)的壓力要求。3.1試劑貯存和打算區(qū)該試驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應干脆運輸至該區(qū)，不得經過其他區(qū)域。試劑原材料必需貯存在本區(qū)內，并在本區(qū)內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的限制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。3.2標本制備區(qū)該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存與其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避開從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避開在本區(qū)內不必要的走動。3.3擴增反應混合物配制和擴增區(qū)該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。止匕外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣本制備區(qū)）的加入和主反應混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應混合液等也可在本區(qū)內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必需打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危急性，其次次加樣必需在本區(qū)內進行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避開氣溶膠從本區(qū)漏出。為避開氣溶膠所致的污染，應盡量削減在本區(qū)內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。3.4擴增產物分析區(qū)該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如運用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。本區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避開擴增產物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。4.0傳遞窗口的尺寸:一般傳遞窗規(guī)格：SAT500500x500x500（工作尺寸） SAT600600x600x600（X作尺寸）干凈傳遞窗規(guī)格：SAT600600x600x600（工作尺寸） SAT1000600x1000x600（工作尺寸）1.4.4用有效的方法對操作區(qū)域和共享器具在試驗前后進行清潔與消毒。設計要求：PCR試驗室可以是分散形式，也可以是組合形式,現要主要是以組合形式為主流。完成一組PCR試驗，通常應經過試劑配制、樣品處理、核酸擴增與產物分析四個試驗過程，若試驗工藝須要，還應增加樣品粉碎過程。一、分散形式PCR試驗室所謂分散形式PCR試驗室，是指完成上述試驗過程的試驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR試驗室，由于各個試驗之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。二、組合形式PCR試驗室所謂組合形式PCR試驗室，是指完成PCR四個試驗過程的試驗用房相鄰布置，組成獨立試驗區(qū)域的形式。對于組合形式PCR試驗室，由于各個試驗間集中布置，簡單造成相互干擾，因此，對總體布局以與屏障系統具有肯定的要求。各室在入口處設緩沖間，以削減室內外空氣交換。試劑配制室與樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染,可以通過限制進風風量大于排風風量達到正壓效果。核酸擴增室與產物分析室應呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品，可以通過限制排風風量大于進風風量達到負壓效果。在志向狀況下，PCR試驗室緩沖間內，可設置正壓，使室內空氣不流向室外，室外空氣不流向室內。PCR試驗室進風由原有中心空調限制，要求將中心空調風口安裝到指定定點，且高度為地面鋪裝好后2600mm處。假如運用熒光PCR儀，擴增室和產物分析室可以合并。若房間進深允許，可設PCR內部專用走廊。須要指出的是在削減室內外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。各個區(qū)域之間應具備單向的試驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的愛護屏障，避開試驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對試驗過程造成污染產生假性結果。試驗室的墻體，包括頂棚，應結構堅固、氣密性好；全部陰角宜采納圓弧形線條過渡；墻體內壁光滑、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿意無縫隙、無滲漏、光滑、耐腐蝕的要求。假如運用熒光PCR儀，擴增室和產物分析室可以合并。若房間進深允許，可設PCR內部專用走廊。須要指出的是在削減室內外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。各個區(qū)域之間應具備單向的試驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的愛護屏障，避開試驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對試驗過程造成污染產生假性結果。試驗室的墻體，包括頂棚，應結構堅固、氣密性好；全部陰角宜采納圓弧形線條過渡；墻體內壁光滑、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿意無縫隙、無滲漏、光滑、耐腐蝕的要求。主要設備試劑打算區(qū) 儀器設備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機等，加樣器、天平除了要專用外，還應有定期校準。 試劑分裝應在超凈臺中進行擴增反應混合液應運用分子生物學級的，試劑制備好后應有質檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果。標本制備區(qū)儀器設備主要有生物平安柜、加樣器、離心機、溫育儀、混勻器等擴增區(qū)擴增區(qū)的主要儀器是核酸擴增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機、可移動紫外燈。擴增儀需進行校準。并配備UPS電源，以防止由于電壓的波動，停電對擴增效果的影響。分析區(qū) 本區(qū)所運用的儀器設備有酶標儀、洗板機、加樣器和水浴箱等干凈試驗區(qū)的緩沖間部分面積不能超過主試驗室的八分之一，這是有規(guī)定的.主體結構：主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內全部陰角、陽角均采納鋁合金50內圓角鋁，從而解決簡單污染、積塵、不易清掃等問題。結構堅固，線條簡明，美觀大方，密封性好。標準的四區(qū)分隔和氣壓調整：將PCR過程分成試劑打算、標本制備和PCR擴增，產物分析四個獨立的試驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立試驗區(qū)設置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調整，使整個PCR試驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環(huán)境的污染?？纱蜷_緩沖區(qū)I,緩沖區(qū)n和pcr擴增區(qū)的排風扇往外排氣，在試驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調的回風口，空氣通過回風口向室內換氣。3、消毒：在三個試驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以與傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑打算區(qū)和標本制備區(qū)還設置移動紫外線燈，對試驗桌進行局部消毒。4、不銹鋼傳遞窗：試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議運用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。5、地面地面建議運用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。6、照明燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。在建設的過程中應留意：?規(guī)范的安裝流程和全面的服務流程。?嚴格依據規(guī)范科學設計的安裝流程。?安裝前須要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進線位置，電話網絡線進線位置，進水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通風孔、進水管和下水管的位置等，志向狀態(tài)的空間尺寸樣本處理區(qū)三、工作區(qū)域與設備要求（一）試劑儲存和打算區(qū)1、2-8C和T5C冰箱2、混勻器3、微量加樣器（覆蓋1-LOOOul）4、移動紫外燈（近工作臺面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）6、專用工作服和工作鞋7、專用辦公用品（二）標本制備區(qū)1、2-8C冰箱、-20C或-80c冰箱2、高速臺式冷凍離心機3、混允器4、水浴箱或加熱模塊5、微量加樣器（覆蓋ITOOOul）6、可移動紫外燈（近工作臺面）7、生物平安柜8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）9、專用工作服和工作鞋10、專用辦公用品如需處理大分子DNA,應具有超聲波水浴儀。（三）擴增反應混合物配制和擴增區(qū)1、核酸擴增儀2、微量加樣器（覆蓋1-lOOOul）3、可移動紫外燈（近工作臺面）4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）5、專用工作服和工作鞋6、專用辦公用品（四）擴增產物分析區(qū)視檢驗方法不同而定?；緝x器設備如下：1、微量加樣器（覆蓋1-lOOOul）2、可移動紫外燈（近工作臺面）3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）4、專用工作服和工作鞋5、專用辦公用品5.人員和樣品的平安是由生物平安柜和定向氣流共同來保證。PCR試驗室設計規(guī)程中規(guī)定人員和樣品必需單向流淌。即從“試劑打算區(qū)到樣品制備區(qū)，再從樣品制備走向擴增區(qū)和產物分析區(qū)”，肯定不能反向流淌，以辟免交叉污